Kütle spektrumu, örnekteki bileşiklerin kolaylıkla hareket
edebilen iyonlara (çoğunlukla pozitif) dönüştürülmesi ve bu iyonların kütle/yük
oranına göre sıralanmasıyla elde edilir. İyonizasyon işleminde, çoğunlukla
kütle dağılımı ana maddeye göre özel olan, bir pozitif tanecikler serisi
meydana gelir. Kütle spektrometresi de bu gerçek üzerine kurulmuştur. Bir kütle
spektrumu kimyasal yapı hakkında önemli bilgiler verir. Spektral veriler, bazı
bakımlardan, infrared ve NMR spektralardan daha kolay tanımlanır; çünkü
bilgiler, bir örneğin, yapısal bileşiminin moleküler kütlesi cinsinden ifade
edilir. Ayrıca verilerden analitin molekül ağırlığı da doğru olarak
saptanabilir. Kütle spektrası kompleks karışımların kantitatif analizlerinde de
kullanılır. Burada, değişik kütlelerdeki iyon akımlarının konsantrasyonla olan
ilişkisinden yararlanılır.
Bir kütle
spektrometrenin şematik diyagramı
Şekilde bir kütle spektrometresinin temel kısımları
görülmektedir. Kütle analizörü, bir optik spektrometredeki elektromagnetik
ışını ayıran prizma veya gratingin görevini yapan ayırıcı bir sistemdir;
buradaki ayırma işlemi örnekten taneciklerin ayrılmasıdır. Kütle
spektrometrenin optik yöntemlerin çoğunda karşılaşılmayan bir özelliği,
dedektöre kadar olan tüm sistemlerin düşük basınç (10-4 –10-8
torr) altında bulunmasıdır; hassas vakum sistemleri kütle spektrometrelerin en
önemli kısmıdır.
Kütle spektrometresi blok diyagramı
Çalışmada aşağıdaki sıra izlenir.
Örnek Verme Sistemi: Bir mikromol (veya daha az)
örnek gazlaştırılarak yavaş bir hızla 10-5 torr basınçtaki iyonizasyon
odacığına gönderilir.
İyon Kaynağı: Örnekteki moleküller, ısıtılan bir
flamandan anoda doğru akan bir elektron akımı tarafından, doğrudan veya dolaylı
olarak iyonlaştırılırlar (iyonizasyon ile hem pozitif ve hem de negatif iyonlar
oluşur, fakat pozitif olanlar çoğunluktadır ve analitik yöntemler de,
çoğunlukla, pozitif taneciklere dayanır). A slitindeki küçük negatif potansiyel
ile pozitif iyonlar negatiflerden ayrılır ve A ile B arasındaki birkaç
yüz-birkaç bin voltluk potansiyel tarafından hızlandırılırlar. Paralelleştirilen
bir pozitif iyonlar demeti B slitinden ayırma bölgesine girer.
Kütle Analizörü: 10-7 torr basınç altında
tutulan analizör tüpünde hızlı hareketli iyonlar kuvvetli bir magnetik alan
içine girerler ve alanın etkisiyle eğri bir yol çizerler. Yolun eğrimi (eğrinin
çapı) magnetik alanın kuvvetine, iyonların hızına ve kütlesine göre değişir.
Hızlandırma potansiyeli veya alan kuvveti değiştirilerek kütleleri farklı
taneciklerin çıkış slitine odaklanması sağlanır.
Dedektör: Çıkış slitinden geçen iyonlar toplayıcı bir
elektrot üzerine düşer ve iyon akımı oluşur. İyon akımı yükseltilir.
Data Sistemi ve Kayıt: Yükseltilen iyon akım alan
kuvveti veya hızlandırma potansiyelinin fonksiyonu olarak kaydedilir.
Bir kütle
spektrumu
Kütle spektrometresi ile çalışmalarda sistemin vakum altına
tutulması gerekir; bunun temel nedeni ortalama–serbest yolu yükseltmektir.
Ortalama mesafe, iyonize moleküllerin, diğer iyon ve moleküllerle
çarpışmalarından önceki yolculuğu olarak tanımlanır; yüksek bir
ortalama-serbest yol, tekrarlanabilir faragmantasyon sağlar ki bu da yüksek hassasiyet
ve güvenilir bir kütle analizi yapılmasına olanak verir. Ortalama-serbest yol,
iyonizasyon kaynağı ve iyon dedektörü arasındaki mesafeden daha büyük
olmalıdır.
Vakum, iki kademeli vakum sistemiyle sağlanır: Birincisi,
bir rotary pompadır; bu kaba veya ön pompadır; 10-2 -10-4
torr vakum sağlar. İkinci pompa bir turbomoleküler veya bir difüzyon pompası
olabilir; vakum 10-5 torr değere ulaşır. Bu pompalar kompresörler
gibi çalışır.
Turbomoleküler pompada bir dizi bıçak veya kanat bulunur;
bunlar 30 000-90 000 rpm hızla dönerken etraftaki gaz moleküllerini aşağı ve
dışarı atarlar. Bir turbo pompa birkaç saat içinde temiz bir vakum ortamı
sağlar. Ancak kullanım süresi kısadır (1-2 yıl) ve gürültülü çalışır.
Turbomoleküler pompa
Yüksek vakum elde etmek için kullanılan, 4-kademeli bir
pompa türüdür. Yağ ısıtılır ve bacalardan (1, 2, 3) yükselir, tepeye
ulaştığında her bir bacanın üst kısmında bulunan deliklerden püskürür; püsküren
her bir tanecik çevresine bulunan gaz moleküllerini toplar ve aşağıya doğru
ittirir. Dördüncü ve son kademede yağ damlaları bir pompayla toplanır ve tekrar
devreye gönderilir. Bu tür pompaların bakımı kolaydır, ancak yüksek vakuma
ulaşmak zaman alır. Ayrıca, iyi dizayn edilmemişse deney örneğine yağ kaçma
olasılığı vardır.
Yağ difüzyon pompası
Örnek verme sisteminin amacı, bir örneğin düşük basınçta gaz
halinde iyon kaynağına gönderilmesidir. Örneğin fiziksel haline göre giriş
sisteminin yapısı da farklı olur; her tipteki örnek düşünüldüğünde birkaç
sistemin olması gerekir.
Örnek Verme Sistemleri
En çok uygulanan örnek hali gazdır ve bunun için 1-5 litrelik
gaz rezervuarları kullanılır. Rezervuardaki gazın basıncı, iyonizasyon
odacığının basıncının bir veya ikinci derecesi kadar daha yüksektir, böylece
odacığa ince bir delikten sürekli ve kararlı bir örnek akımı sağlanır; örnek
basınçları için 0.01 torr tipik bir değerdir. 150 0C'nin altında
kaynayan sıvı örneklerle çalışıldığında, uygun bir miktar alınarak oda
sıcaklığında, havası boşaltılmış bir rezervuarda gazlaştırılır. Daha az uçucu
örnekler durumunda, maddenin ısıl olarak kararlı hale gelmesi için, örnek ve
rezervuar ısıtılabilir. Aksi halde, örneğin özel bir cihaz ile doğrudan
iyonizasyon odacığına verilmesi gerekir.
Bir yığın (batch)
giriş sistemi şematik görünüşü
Doğrudan buhar girişi, en basit örnek verme tekniğidir. Gaz
halindeki analit bir iğne valfle, kütle spektrometresinin kaynak bölgesine
verilir. Örnekte bulunabilecek hava pompa çıkış hatlarıyla uzaklaştırılır.
Bu tip örnek verme tekniği gazlar, sıvılar ve yüksek buhar
basınçlı katılar için uygundur. Düşük buhar basınçlı örnekler için, örnek
önceden ısıtılarak buhar basıncı yükseltilir. Yöntem, kararlı bileşiklere uygun
olduğundan ve makul sıcaklıklara izin verdiğinden çok sayıda örneğe
uygulanamaz.
DIP tekniği, buhar basıncı düşük olan sıvılar ve katıların
kütle spektrometresine verilmesinde kullanılan bir yöntemdir. İşlemde, örnek,
ısıtılmış bir kovanın ucundaki kısa bir kapiler tüpe yüklenir. Kovan, bir vakum
kanalıyla kaynak bölgesine gönderilir. Probun gerekli konuma ayarlanmasından
sonra kapiler tüpün sıcaklığı, örneğin buharlaşmasını sağlayacak bir seviyeye
kadar yükseltilir. Bu prob, direkt buhar girişiyle uygulanabilen sıcaklıklardan
daha yüksek sıcaklıklarda çalışmaya olanak sağlar. Ayrıca. Örnek vakum
atındadır, ve kaynağa çok yakın bir konumdadır; bu durum analizin daha düşük
sıcaklıklarda yapılmasını sağlar. Düşük sıcaklıkta analiz, sıcaklığa karşı
hassas bileşikler için çok önemlidir.
DIP tekniği, doğrudan buhar girişine (Direct Vapor Inlet)
kıyasla daha zahmetli olmasına karşın pek çok örneğin analizinde
kullanılmaktadır.
Bir doğrudan giriş probu
d. Gaz
Kromatografisi Giriş Sistemleri
Bir kütle spektrometreye örnek verme işleminde uygulanan en
popüler teknik gaz kromatografisidir. Kompleks karışımlar önce gaz
kromatografisi ile ayrılır, her bir bileşenin tanımlanması ve miktarlarının
saptanması için kütle spektrometresine verilir. Bu iki cihazı (GC-MS) birbirine
bağlamak için çeşitli arayüz (interface) dizaynları kullanılmaktadır.
Girişlerin en önemli karakteristiğini, kütle spektrometreye giren GC taşıyıcı
gazın ve analitin miktarlarının ayarlanması oluşturur. Taşıyıcı gazın fazla
olması kaynak bölgesinin basıncının artmasına neden olur. Bu durumda bölgenin
gerekli basıncının devam ettirilmesi için daha büyük ve güçlü vakum pompasına
ihtiyaç doğar (ki bu çok pahalıdır). Kütle spektrometreye giren analit miktarı,
cihazın algılama sisteminin geliştirilmesi (dedektör) yönünden önemlidir. İdeal
hal, kütle spektrometrenin kaynak bölgesine taşıyıcı gaz girmesine izin
vermemek ve fakat analitin tamamının girmesini sağlamaktır.
GC/MS arayüzler çok çeşitlidir; moleküler separatör,
permeasyon seperatör, açık slit ve kapiler giriş kullanım alanları fazla olan
bazı arayüzlerdir.
Bazı
tipik gaz kromatografisi giriş sistemleri
Gaz kromatografisinde özellikle dolgulu kolonlar
kullanılması durumunda yararlanılan çok popüler bir sistemdir; çalışma prensibi
relatif difüzyon hızına dayanır: Küçük moleküllerin difüzyonu daha hızlı
olduğundan, pek çoğu, kütle spektrometrenin giriş jetini yakalayamaz; oysa daha
büyük moleküller daha yavaş difüzlendiğinden MS giriş jetine ulaşma şansları
çok yüksek olur.
Bu tip bir sistemde, GC ve kütle spektrometresi arasında
yarı-geçirgen bir membran bulunur. Bu teknikte karşılaşılan sorunlar arasında:
örneğin molekül ağırlığı ve polaritesine bağlı olarak membran seçiminin farklı
olması, algılamanın yavaşlığı ve membrandan analitin sadece az bir miktarının
geçebilmesi sayılabilir.
Bu arayüzde kütle spektrometresine verilen akım, kapiler
kolon çıkışlarında olduğu gibi, genellikle ~1 mL/dak ile sınırlandırılmıştır;
bunun üstünde akım geldiğinde akımın fazlası atılır. Açık split arayüz herhangi
bir gaz üretin sisteminde kullanılabilir, ancak split sırasında örneğin de
dışarı atılması gibi bir dezavantajı vardır.
GC cihazında sadece kapiler kolon kullanılması halinde,
kolon çıkışının tümüyle kütle spektrometresine verilmesi sistemine göre çalışan
bir arayüzdür.
Bir kütle spektrometreye az uçucu bileşikler için örnek
verme işleminde uygulanan tekniklerden biri de sıvı kromatografisidir. Kompleks
karışımlar önce sıvı kromatografisi ile ayrılır, her bir bileşenin tanımlanması
ve miktarlarının saptanması için kütle spektrometresine verilir. LC-MS
sistemlerini birbirine bağlamak için, GC-MS sistemlerinde olduğu gibi çeşitli
arayüzler (interface) kullanılmaktadır. Aşağıda bazı arayüzler kısaca
tanımlanmıştı.
Bu teknikte sıvı kromatografi cihazından gelen akımın bir
kısmı, çapı ~2.5 mm olan bir orifisten doğrudan injekte edilir. İnjektörden
basınçla çıkan sıvı ince spreyler halinde dağılır, damlalar ısıtılan bir
odacıkta buharlaştırılarak çözgeninden kurtulur ve sonra iyonizasyon odacığına
girer.
Termosprey arayüz doğrudan giriş sisteminin doğal bir
uzantısı gibi düşünülebilir; giriş tüpünü ucu uygun bir sıcaklığa ısıtılarak
örnek damlacıklarının buharlaşması kolaylaştırılır. Optimum arayüz sıcaklığı
hareketli fazın bileşimine bağlıdır.
Sürekli (continue) bir örnek giriş sistemidir. Sıvı birkaç
mikron çapında damlacıklar halinde atomize edilir ve solventin büyük bir kısmı
buharlaşıncaya kadar ısıtılır. Tanecikler, püskürtmeyle buharlaştırılarak kütle
spektrometrenin iyonizasyon bölgesine gönderilir.
Elektrosprey arayüz atmosfer basıncında çalışır; bu özelliği
nedeniyle vakum altında (1-10 torr) çalışan termosprey tekniğinden ayrılır.
Örnek çözeltisi, iyon orifisinden 1 cm kadar mesafedeki paslanmaz çelik bir
kapilerin ucundan (jet) püskürtülür. Orifis levhası ve jet arasına uygulanan
3-5kV potansiyel damlacıkların iyonlaşmasını sağlar. Elektrospreyin iyonlaşma
verimi iyonizasyon potansiyeline bağlı olarak değişir. Potansiyel farkının
artırılması başlangıçta damlacık boyutunu yükseltir, ancak iyon oluşması
gerçekleşemez. Ancak voltajın daha fazla yükseltilmesi halinde sisle kaplanan
tanecikler yüklenir ve iyonlaşırlar.
Bazı
tipik sıvı kromatografisi giriş sistemleri
Molekülleri gaz iyonlar şekline dönüştüren çok sayıda yöntem
vardır; kütle spektrometresinde uygulanan bazı iyonizasyon kaynakları:
Uçucu bileşikler için:
·
Elektron Impact İyonizasyon (EI)
·
Kimyasal İyonizasyon (CI): Pozitif kimyasal iyonizasyon
(PCI), ve negatif kimyasal iyonizasyon (NCI) kaynaklar
Uçucu olmayan
bileşikler için:
·
Hızlı Atom Bombardımanı (FAB); Atmosferik Basınç
İyonizasyon (API); MALDI
Elektron
iyonizasyon (EI) kaynağı şematik
Elektron iyonizasyon yöntemine, elektron impact iyonizasyon
da denir; “sert” iyonizasyon tekniğidir, 10-5 torr yüksek vakum
altında çalışılır. GC-MS bağlantılı sistemlerde kullanımı oldukça yaygındır.
Kütle spektrumunun alınabilmesi için aşağıdaki iyonizasyon
işlemini başlatabilecek minimum miktarda bir elektron-demeti enerjisine (pek
çok organik bileşik için 7-15 eV kadar) gereksinim vardır.
M + e- ¾® M+ + 2e-
M molekülü, M+ 'da "moleküler iyon"u
veya "ana iyon"u gösterir. Elektron demeti enerjisinin az miktarda
fazlası, iyon-üretici çarpışmalar olasılığının artması nedeniyle, daha fazla
moleküler iyon oluşmasına yol açar. Demet enerjisindeki büyük artışlar,
moleküler iyon pikinin küçülmesine de neden olabilir; böyle bir durumla, ilave
edilen enerjinin ana iyondaki elementler arasındaki bağı (veya bağları) kopararak
daha küçük (bazan da daha büyük) kütleli taneciklerin üretilmesinde karşılaşılır.
Böyle bir işlem, aşağıdaki ABCD molekülü için açıklanabilir.
Çok sayıda atom içeren bir molekülden üretilen farklı
pozitif iyonların sayısı fazla olur. Dağılım, ilk üretilen iyonun kararlılığına
ve elektron demetinin moleküle verdiği enerjiye bağlıdır.
Denklem (b), (c) ve (d)‘deki nötral tanecikler radikaller
şeklinde gösterilmiştir. Bunlar molekül halinde de bulunabilirler.; her iki
tipi de dedektöre ulaşamazlar.
Analiz edilecek örnek, doğrudan bir giriş yoluyla veya gaz
kromatografi kolonundan iyon kaynağı içine verilir. Isıtılmış tungsten veya
renyum gibi bir flamentten üretilen bir elektron demeti gaz halindeki örnek
molekülleriyle çarpışır, bir elektron bırakır ve pozitif yüklü bir iyon üretir;
iyon, örneğin relatif kütlesini gösterir. Isıtılan bir flamentten çıkan elektronlar, bir potansiyel farkıyla
hızlandırılarak örnek odacığına gönderilir. Örnek molekülü, bir elektron
kaybederek iyonlaşır ve çiftleşmemiş bir elektron içeren pozitif yüklü iyon
haline dönüşür.
Elektron iyonizasyon kaynağı, molekülleri çeşitli kütlelerde
çok sayıda pozitif iyonlara bölebilecek yeterli enerjiye sahiptir. Maddenin
tanımlanması alınan karmaşık spektrumdan doğru olarak yapılabilir.
Elektron iyonizasyondan daha “yumuşak” bir iyonizasyon
tekniğidir; fragman sayısı daha azdır. Pozitif ve negatif iyon şekilleri
vardır.
Kimyasal bir iyonizasyon kaynağında metan gibi bir reaktif
gaz, 1 torr kadar basınçta, özel bir elektron demeti kaynağı içine konulur.
Aynı kaynak içine, konsantrasyonu reaktifin 10-3 –10-4
katı olacak şekilde örnek ilave edilir. Örnek moleküllerinin elektronlar yerine
reagent iyonları ile çarpışması sonucunda iyonlaşma meydana gelir. Başlangıçta,
elektron demeti reaktif gaz ile etkileşerek CH5+ , CH4+
, CH2+, H2+, ve C2H5+
gibi çok sayıda iyon oluşturur.
CH4 + e- ¾® CH4+· + 2e- ¾® CH3+· + H
CH4+· + CH4 ¾® CH5+ + CH3·
CH4+· + CH4 ¾® C2H5+ + H2
+ H·
Bu iyonlardan birkaçı (CH5+ gibi),
kuvvetli proton vericidir ve analit molekülleri ile reaksiyona girerek kütlesi
bir birim daha büyük (M+1) iyonlar meydana getirirler. Örneğin,
CH5+ + MH ¾® MH2+ + CH4
reaksiyonu ile MH analitinden MH2+
iyonu oluşur. Bu tür iyonizasyonda, çoğunlukla, kimyasal iyonizasyon kaynağı
analitten çok az cins iyon üretir, bu nedenle de kütle spektrumu basittir ve
kolaylıkla tanımlanabilir.
Reaktif gaz izobütan olduğunda,
i-C4H10 + e- ¾® i-C4H10+· + 2e-
i-C4H10+· + i-C4H10 ¾® i-C4H9+ +
C4H9 +H2
Reaktif gaz olarak amonyak da kullanılabilir (102
torr).
70 eV
NH3 + e- ¾¾®
NH3+·
+ 2e-
NH3+· + NH3 ¾¾®
NH4+ + NH2·
NH4+
+ NH3 ¾¾® N2H7+
Kimyasal iyonizasyonda spektrometrenin iyon kaynağı, yüksek
basınçta tutulur.
Bazı Reaktif Gazlar ve Özellikleri
Pozitif kimyasal iyonizasyon (PCI) işleminde proton transfer
reaksiyonuyla kuvvetli moleküler iyon [analit–H]+ meydana gelirken, negatif
kimyasal iyonizasyon işleminde (NCI) [analit-·] kuvvetli moleküler iyon oluşumuyla
sonuçlanan elektron yakalama reaksiyonu geçekleşir.
NH4+ +
analit ¾¾® [analit – H]+ +
NH3
e- + analit ¾¾® analit-·
Proton transfer reaksiyonu için analiz edilen bileşik bir
proton alabilmelidir; aminler ve alkoller gibi. Elektron yakalama reaksiyonunun
oluşabilmesi için ise, bileşiğin bir elektron alabilme özelliğinde olması
gerekir; örneğin, F, Cl, Br, I gibi elektronegatif atomlar ve fenil halkası
(veyahalkaları) içeren konjuge sistemler bu özelliktedir.
İyonizasyon tekniği uygulanırken bileşiğin yapısına göre
teknik seçimi yapılmalıdır.
Aşağıdaki şekilde molekül ağırlığı 165 olan efedrinin,
(a) elektron impact iyonizasyon
ve,
(b) kimyasal iyonizasyon
spektrumları verilmiştir.
EI spektrumda (Şekil-a) ana molekülün parçalanmasıyla oluşan
küçük taneciklere ait çok sayıda pik vardır. Moleküler iyon piki 165 görülmez;
sonuç olarak da bileşiğin molekül ağırlığı saptanamaz. 58 deki temel pik (CH3CH
= NHCH3)+ taneciğini gösterir.
Şekil-b, aynı maddenin kimyasal iyonizasyon spektrumudur.
Burada kuvvetli bir (M+1) piki bulunur. Bu pik,
MH + CH5+ ¾® MH2+ + CH4
gibi bir reaksiyonla oluşur. (M-1) piki de,
MH + C2H5+
¾® M+ + C2H6
reaksiyonuna benzer bir reaksiyonla meydana gelir. Bu
spektrumdan bileşiğin molekül ağırlığı
tayin edilebilir.
Efedrin, C10H15NO
(165.23)
Efedrinin, (a)
elektron iyonizasyon (EI), ve (b)(izobütan reaktifi ile kimyasal iyonizasyon
(CI) kütle spektrumları
Şekil: Aminoasit metioninin, (a) 70
eV EI, ve (b) metan reaktif gaz ile CI kütle spektrumları
FAB ve LSIMS
kütle spektrometrenin mekanizması
FAB’da kullanılan tanecik demeti, nötral bir inert gazdır;
4-10 kV ‘da Ar, Xe gibi.
LSIMS’de ise tanecik demeti iyonlardır; genellikle 2-30
keV’de Cs+ kullanılır. Her iki metot da “yumuşak” iyonizasyon
metodudur; iyonların çıkışından sonra çok az kalıntı enerji kalır. Bu nedenle
uçuculuğu düşük olan moleküllerin analizlerinde çok uygundur.
FAB ve LSIMS teknikleri birbirlerine çık benzer; her
ikisinde de örnek probunun ucunda analit/matriks karışımının katı noktaları,
hızlı tanecik demetiyle bombardıman edilir. Matriks, gliserin veya 3-nitro
benzil alkol gibi küçük bir organik moleküldür; amacı, örnek yüzeyini homojen
tutmaktır. Analit/matriks yüzeyi üstüne giren tanecik demeti lokalize
çarpışmalarla enerjisini transfer eder; bu işlemde yüzeyden bazı ikincil
iyonlar çıkar. Bunlar ekstrakt edilir ve kütle spektrometreye gönderilmeden
önce odaklanır.Üretilen iyonların
polaritesi kaynak potansiyeline bağlıdır. Şekil, bir pozitif iyon demeti
oluşumunu göstermektedir.
Elde edilen spektrada önemli miktarda [M+H]+ and [M+Na]+
gibi, bozulmamış moleküler tanecikler bulunur, yapısal parçalanma çok azdır.
Spektranın düşük kütle bölgesinde, gene de matriks ve matriks/tuz küme iyonları
vardır.
API yöntemi, özellikle sıvı kromatografisi-kütle
spektrometresi (LC/MS) sistemi için kullanım alanı çok yaygın olan bir
iyonizasyon tekniğidir; iyonizasyon vakum sisteminin dışında meydana gelir.
Örneğin çözelti halinde olması gerekir. İki tip API vardır:
·
Elektrosprey iyonizasyon (ES)
·
Atmosferik basınç kimyasal iyonizasyon (APCI)
Elektrosprey iyonizasyon ESI, ES, IS kodlarıyla
tanımlanabilir; ayrıca, iyon sprey, nanosprey, sonik sprey ve saf elektrosprey
de denilmektedir. En yumuşak iyonizasyon tekniğidir. Polar ve uçucu olmayan
bileşikler için ideal bir iyonizasyon yöntemidir; bunlar arasında, proteinler,
peptitler, nükleik asitler, farmasetikler ve doğal ürünler sayılabilir.
Elektrosprey
iyonizayon (ESI) şematik görünümü
Sıvı kromatografi ile birleşik olarak kullanılabilir. Yüklü
buhar damlacıklarından gaz faza geçen iyonlar M+H+ veya M - H- iyonları üretir.
Çok yüklü iyonlar da üretebilmesi yüksek molekül ağırlıklı proteinlerin
analizine olanak verir.
ESI kaynak, yüksek voltaj (4.5 kV) uygulanabilen çok ince
bir iğne içerir; örnek çözeltisi bu iğne içinden kaynak odacığına püskürtülür,
ve damlacıklar halinde dağıtılır. Damlacıklar kapilerden çıkarken yüklüdürler;
solvent buharlaşırken yüklü analit moleküllerini bırakırlar ve damlalar
kaybolur.
ESI, özellikle buharlaştırılması ve iyonlaştırılması zor
olan büyük biyolojik moleküller için faydalı bir iyonizasyon tekniğidir.
Atmosferik basınç kimyasal iyonizasyon (buna, Heated
nebuliser, APCI da denir) polar bileşikler için kullanılan bir iyonizasyon
tekniğidir.
Yüksek performans sıvı kromatografisinden (HPLC) gelen akım
(< 2 mL/dak akış hızı) 600 0C’da buharlaştırılır. Korona deşarj
iğne solvent moleküllerini iyonlaştırır. Solvent ve analit arasındaki
çarpışmalar ve yük transfer reaksiyonlarının etkisiyle ya M+H+ veya M-H-
iyonlarının oluşmasına yol açan proton transferi meydana gelir. Bileşikler
termal parçalanmaya uğrar. Çok değerli iyon oluşumuyla fazla karşılaşılmaz.
Atmosferik
basınç kimyasal iyonizasyon (APCI)
Hızlı atomik bombardıman (FAB) iyonizasyona benzer. Örnek,
spesifik bir dalga boyundaki kısa pulslu lazerden gelen ışını absorblayan
matriks içinde çözülür, iyonlaşır ve kütle analizörlerinde ekstrakt edilir. Zaman-yol
bağımlı kütle spektroskopiyle (TOF, Time
of Flight MS) bileştirilerek kullanılır, fakat sıvı kromatografisiyle uygun
değildir. Yüksek kütle sayılarına çıkabilme özelliği nedeniyle kullanımı
oldukça yaygın bir iyonizasyon yöntemidir.
MALDI hem pozitif ve ham de negatif iyonlar üretir; bunlar
genellikle (M+H)+, (M+Na)+ ve (M-H)- şeklindedir. Ayrıca, +3’e kadar çok yüklü
iyonlarla, dimerler, trimerler, v.s. de meydana gelir. Ana pik (veya pikler)
sadece bir yük taşır.
Farklı kütle/yük oranlarındaki iyonların resolusyonu
(ayrılması) için birkaç sistem vardır. En ideali, analizörün çok küçük kütle
farklılıklarını algılayabildiği ve buna bağlı olarak yüksek seviyeli iyon
akımlarının üretilebildiği bir düzenektir. Bu iki özellik, doğrudan doğruya,
birbirinin neden ve sonucu olmadığından aradaki ilişkiyi sağlayan bir sistem
bulundurulur. Bazı uygulamalarda kütle sayıları farkının tam sayı olması
yeterlidir, bazılarında ise farkın daha hassas
olması gerekir; Örneğin, C2H4+, CH2N+,
N2+, ve CO+ iyonlarının saptanması için kütle
farkı 0.01 kütle birimi hassasiyetle bilinmelidir (kütleleri, sırasıyla,
28.031, 28.019, 28.006, ve 27.995 tir).
Çeşitli kütle spektrometreleri arasındaki temel farklılık,
iyonları ayırma sistemleridir.
Farklı Kütle Analizörlerinin Özellikleri
Aşağıda tipik bazı kütle analizör tipleri verilmiştir.
- Magnetic
Sektör Analizörü (MSA)
- Tek
Odaklamalı: Yüksek rezolusyon, tam kütle, orijinal MA
- Çift
Odaklamalı: Enerji seçimini yapan elektrostatik alan ve m/e için magnetik
alan
- Kuadrupol
Analizör (Q): Düşük rezolusyon (1 amu), hızlılık
- Zaman-Yol
Bağımlı Analizör (TOF): m/z üst sınır yoktur
- İyon
Kapanı Kütle Analizörü (QSTAR): İyi rezolusyon
- FT-Iyon
Siklotron Rezonans MS (FT-ICR MS): Çok yüksek rezolusyon, tam doğru kütle;
1ppm
a. Magnetic
Sektör Analizörü (MSA)
(Yüksek rezolusyon, tam kütle, orijinal MA)
Tek odaklamalı bir
kütle spektrometrenin şematik diyagramı
Tek odaklamalı ayırıcılarda 180, 90 veya 600 lik
bir dairesel demet yolu kullanılır; örneğin, yukarıdaki şekilde görülen
spektrometrede 900 lik bir yol izlenmektedir. Herhangi bir taneciğin
takip ettiği yol, ona etki eden kuvvetler arasındaki dengeyi belirler. Magnetik
merkezcil kuvvet, FM,
Buradaki V, iyonizasyon odacığındaki uygulanan hızlandırma
potansiyelidir. Formüle göre kütlelerine bağlı olmaksızın, yükleri aynı olan
tüm tanecikler, elektrik alanında hızlandırıldıklarında, ayni miktarda kinetik
enerji kazanırlar. Bu varsayım sadece yaklaşık olarak doğrudur; çünkü iyonlar
hızlandırılmadan önce de az miktarlarda, fakat farklı enerjiler içerirler. Bir
taneciğin kollektöre giden dairesel yolu geçebilmesi için FM = Fc
eşitliğinin sağlanması gerekir; bu durumda:
(Enerji seçimini yapan elektrostatik alan ve m/e için magnetik
alan)
Tek odaklamalı cihazların küçük kütle farklarını (ki bu
ayrılma gücüdür) ayırma yeteneği sınırlıdır; çünkü iyon kaynağını terk ederken
taneciklerin sahip oldukları kinetik enerjiler birbirinden az miktarda farklıdır.
Şekil (a): Bir
çift-odaklamalı ayırıcı ve (b): çift-odaklamalı kütle spektrometresi
Nötral moleküllerin kinetik enerjilerinin başlangıçtaki
dağılımından kaynaklanan bu farklılık, kollektöre ulaşan iyon demetinin
genişlemesine ve ayrılma gücünün kaybolmasına neden olur.
Çift-odaklamalı bir cihazda, demet önce radyal bir elektrostatik
alandan geçer (Şekil-a). Bu alan ayni kinetik enerjili tanecikleri 2 numaralı
slit üzerinde odaklar ve sonra magnetik ayırıcı için kaynak görevi yapar.
Böylece birbirinden bir birim kütlenin küçük kesirleri kadar farklı olan
taneciklerin ayrılması sağlanabilir. Üretilen iyon akımları çok çok küçüktür ve
algılanıp kaydedilmesi için büyük amplifikasyona gereksinim vardır.
Çift-odaklamalı kütle spektrometreler çok pahalı ve bakımı oldukça zor olan
enstrümanlardır.
Şekil-b'de, Mattauch-Herzog geometrisine göre hazırlanmış
diğer bir çift- odaklamalı cihazın şematik görünümü verilmiştir. Bu geometrik
yapı, değişik kütle/yük oranındaki tüm iyonların tek bir odak düzlemi üzerinde
toplanmasına olanak verir; bu durumda fotoğrafik algılama yapılabilir. Odak
düzlemi boyunca kütle/yük oranı ile doğrusal bir dağılım gözlenir.
(Düşük rezolusyon; 1 amu, hızlılık, güçlü bir kromatografisi
dedektörü)
Güçlü bir gaz kromatografisi dedektörüdür. Örnek
kromatografi kolonundan çıktıktan sonra, kütle spektrometrenin girişinde
bulunan bir transfer hattından geçer ve bir elektron-şok iyon kaynağıyla
(electron-iyonizasyon, EI) veya kimyasal iyonizasyonla (CI) iyonlaştırılır,
fragmanlara (parçacıklar) ayrılır.
Dört kutuplu bir (kuadrupol)
analizör
Dört kutuplu (kuadrupol) analizörler dört paralel çubuktan
oluşur; karşılıklı çubuklar aynı polaritede, komşu çubuklar zıt polaritededir.
Her bir çubuğa doğru akım (DC) ve radyo frekansı (RF) voltaj uygulanır; DC/RF
kuadrupol voltajları değiştirilerek iyonlar taranır. RF alanda, sadece seçilmiş
kütle/yük oranındaki iyonlar doğru osilatör yolu izlerler. Alanlardan ikisi de
iyon kaynağından çıkan pozitif tanecikleri hızlandıracak bir etki yapmaz, fakat
birleştirilen alan, taneciklerin kendi hareketlerinin merkez eksenini etrafında
titreşmesine neden olur; böylece çubuklardan biri ile çarpışarak saptırılmadan,
sadece bazı kütle/yük oranındaki tanecikler geçebilirler. Uygulanan alternatif
akımın veya iki kaynağın potansiyellerin değiştirilmesi, fakat oranın sabit
tutulması ile kuadrupol spektrumu çizilir.
Üç kademeli
kuadrupol (TSQ) bir kütle analizörü
Bir MS/kuadropol
MS sistemin şematik görünümü
Zaman-yol bağımlı bir analizördeki ayırmada magnetik etki
bulunmaz. Bunda, kısa süreli bir elektron pulsu ile bombardıman yapılarak
pozitif iyonlar üretilir. Delikli bir levha ile kontrol edilen pusların
frekansı 10000 Hz, yaşam süreci 0.25 s kadardır. Üretilen iyonlar daha sonra
iyonizasyon pulsu ile aynı frekanstaki bir elektrik alanı pulsu ile
hızlandırılır. Hızlandırılmış tanecikler, bir metre boyundaki elektrik alanı
bulunmayan bir "ayırma tüpü"ne girerler (Şekil). Daha önce değinildiği
gibi, tüpe giren tüm taneciklerin kinetik enerjisi aynıdır; böylece her birinin
hızı, kütleleri ile ters orantılı olacak şekilde farklı olur. Daha hafif
tanecikler kollektöre ağırlardan daha kısa zamanda ulaşırlar.
Zaman-yol bağımlı kütle spektrometrelerdeki dedektör bir
elektron multiplier (çok kademeli) tüptür; tüpün çıkışı bir katot ışını
osilaskopun dikey döndürme levhalarına beslenir, yatay tarama hızlandırma
pulsları ile senkronize edilerek kütle spektrumun tamamı osilaskop ekranında
hemen görüntülenir.
Zaman-yol bağımlı
bir kütle spektrometrenin şematik görünümü
Ayırma gücü, tekrarlanabilirlik, ve kütlelerin tanımlanma
kolaylığı bakımından zaman-yol bağımlı analizörler magnetik odaklamalı
analizörler kadar yeterli değildir. Ancak bunların da bazı avantajları vardır;
iyon kaynağına kolaylıkla yerleştirilebilmesi, uçucu olmayan veya
ısıya-dayanıklı örneklerle çalışmayı kolaylaştırır. Ayrıca yaşam süreci kısa
olan örneklerde sonucun hemen alınmasına olanak vermesi bakımından önemledir.
Zaman-yol bağımlı analizörler, çoğunlukla, küçüktür, taşınabilir ve karşıtı
olan magnetik odaklamalı sistemlere göre kullanımı daha kolaydır.
İyon kapanı analizörü, kuadrupol kütle spektrometrenin
modifiye edilmiş br şeklidir. Kombine bir GC/MS enstruman sisteminden daha çok,
bir gaz kromatografisi dedektörü olarak dizayn edilmiştir.
İyon kapanı analizöründe üç elektrot bulunur. Merkez
elektrot halka; üst ve taban elektrotlar yarım küre şeklindedir. İyonizasyon ve
kütle analizi aynı yerde gerçekleşir. Ayrılan iyonlar bir iyon dedektörüyle
ölçülür; kullanımı en yaygın olan dedektör, sürekli dinod tip bir iyon
dedektörü olan elektron
multiplierlerdir.
MS/iyon kapanı
(IT) sistemin şematik görünümü
(Çok yüksek rezolusyon, tam doğru kütle; 1ppm)
FT-ICR kütle spektrometresinde sabit bir magnetik alanda
iyonların siklotron frekansından yararlanılarak geliştirilmiş bir
spektrometredir.
Bir ICR
kapan
İyonlar özel bir kapanda tutulur (yüklü tanecikleri
depolamak için sabit magnetik alan ve sabit elektrik alanının uygulandığı bir
kapan) ve burada magnetik alana dik bir osile bir elektrik alanı tarafından
daha büyük bir siklotron çapına uyarılır; Alınan sinyal, zamanın fonksiyonu
olarak görüntü akımı (zaman-bağımlı) olarak kaydedilir. Fourier transform ile
zaman-bağımlı sinyal frekans-bağımlı spektruma, yani kütle spektrumuna
dönüştürülür.
Spektrumdaki pik genişlikleri çok dardır; dolayısıyla benzer
m/z değerindeki iki farklı iyonu algılayabilecek hassasiyete sahiptir. Örneğin,
800.000 Da kütledeki bir pik, 800.001 Da kütledeki bir pikten ayırt edilebilir.
FTICR kütle spektrometresi, yeni bölünme (veya parçalanma )
tekniklerinin kullanılmasına olanak verir; örneğin, infrared lazer aktivasyon,
elektron-yakalama disosiyasyon gibi. Bu teknikler tüm proteinlerde olduğu gibi,
çok büyük molekül parçalarını incelemede kullanılmaktadır.
FT-ICR MS uygulamalarına bazı örnekler verilebilir:
Makromoleküller, kalıntı analizleri, meabolomikler, proteinler, peptidler,
kompleks karışımlar (örneğin, ham petrol gibi), izotoplar, v.s.
6.
DATA SİSTEMİ VE KAYIT
Ayırıcıdan gelen iyonlar bir slitten geçerek, sapmış
iyonlara karşı korunan bir elektrot üzerinde toplanır. Cihazların çoğunda,
üretilen akım büyük bir dirençten toprağa verilirken oluşan potansiyel düşmesi
bir elektrometre tüpünün kafesinde veya bir alan etkili transistörde algılanır.
Oluşan akım yükseltilerek kaydediciye gönderilir.
Başka bir yöntemde, ayırıcıdan gelen iyonlar bir katot
yüzeyine çarparak elektron çıkarırlar. Oluşan elektronlar bir diyota doğru
hızlandırılırlar ve diyota çarparak yeni elektronlar üretirler. Bu işlem bir
kaç kez tekrarlanarak, bir fotomultiplier tüpte olduğu gibi, çok fazla
yükseltilmiş bir elektron akımı elde edilir. Bu akım elektronik olarak bir
yükseltme aşamasından daha geçirildikten sonra kaydedilir.
Şekil: n-bütanın farklı algılamalı dört galvanometreli bir cihazda çizilmiş kütle spektrumu (yukarıdan aşağı doğru galvanometre algılamaları: 30:10:3:1)
İyon akımları normal olarak küçüktür ve 10-17 –10-9
A0 aralığında değişir. 10-17 A0 'lik bir akım,
dedektöre saniyede 60 kadar iyonun ulaşması demektir. Değişik miktarlardaki
iyonların oluşturduğu pikleri kaydetmek için kütle spektrometrelerin çoğunda,
farklı akım aralıklarını kaydeden, birkaç kalem bulunur. Böylece, akımın
büyüklüğüne bağlı olmaksızın, kaydedici kağıtta uygun büyüklükteki her pik görülebilir.
Bazı cihazlarda, hassas kağıt üzerine kayıt yapan bir aynalı
galvanometreler sistemi vardır; her bir galvanometrenin farklı algılama
aralığında olması geniş bir aralıktaki piklerin tümünün kaydedilmesine olanak
verir.
Kütle spektrometrelerde minikompüterler ve mikroprosesörler
cihazı tamamlayıcı sistemlerdir. Bir kütle spektrumunun en önemli özelliği
verdiği yapısal verilerin çokluğudur. Örneğin, molekül ağırlığı 400-500
arasında olan bir molekül, bir elektron demeti ile 200 kadar değişik iyona
bölünür, bunların herbiri de farklı spektral pik verir. Yapısal bir tayin için
her bir pikin yüksekliğinin ve kütle sayısının saptanması, toplanması, ve
görüntülenmesi gerekir. Verilerin sayısının çok fazla olması, bunların hızla
toplanmasını ve süratle işlemlendirilmesini gerektirir; bu ise en ideal şekilde
bilgisayarlarla yapılabilir. Kütle spektral verilerinin faydalı olabilmesi için
veriler toplanırken birkaç enstrumantal değişkenin de çok sıkı bir şekilde
kontrol edilmesi gerekir. Bu tip kontroller en iyi bilgisayarlar veya
mikroprosesörlerle yapılabilir.
Bir kütle spektrometresi ve bir bilgisayar arasındaki ara
yüz, yükseltilmiş iyon-akımı sinyali ve enstrumantal değişkenlerin kontrolünde
kullanılan diğer sinyalleri sayısal hale dönüştürür. Enstrumantal değişkenleri
kontrol eden sinyallerin kaynakları, kaynak sıcaklığı, hızlandırma voltajı,
tarama hızı ve magnetik alan kuvveti gibi parametrelerdir.
Sayısal hale dönüştürülen iyon-akımı sinyali görüntülenmeden
önce bazı işlemlerden geçirilir. Önce, pikler normalize edilmelidir; bunun için
her bir pikin yüksekliği, referans bir pike karşı hesaplanır. Bu işlemde
çoğunlukla, en yüksek pik referans olarak alınır ve bunun yüksekliği 100 (veya
1000) kabul edilir. Her pikin bir kütle numarası da olmalıdır. Numaralama pikin
çıkış zamanı ve tarama hızına göre yapılır. İşlemde periyodik kalibrasyona
gereksinim vardır. Kalibrasyonda standart olarak fluorlu bir hidrokarbon
kullanılır. Yüksek rezolusyonlu çalışmalarda örnek ve standard beraberce
analize alınır. Sonra bilgisayar, kütle ölçümlerinde standardın pikini referans
olarak algılayabilecek şekilde programlanır. Düşük-rezolusyonlu çalışmalarda,
benzer pikler üst üste düşeceğinden, kalibrasyon ayrı olarak taranır.
Zaman dışındaki değişkenler kütle numarasını belirlemede
kullanılır. Dört kutuplu spektrometrelerde yapılan analizlerde dedektöre ulaşan
iyonun kütlesi çubuklar arasına uygulanan alternatif akım voltajı ile doğru
orantılıdır. Bu nedenle, bir çubuk voltaj sinyali sayısal hale dönüştürülerek
iyon-akımı sinyali üzerine bindirilir. Bilgisayar da, kütle numarasını sonuçta
elde edilen sinyalden hesaplayacak şekilde programlanır. Magnetik
enstrumanlarda bir Hall probu bulunur, kütle verileri bu prob ile ölçülen
magnetik alan kuvvetine göre çıkarılır.
Kütle
spektral verilerinin bilgisayar görünümü; madde bir kan serumu ekstraktından
krotomatografi ile ayrılmıştır. Spektrum maddenin barbütürat, pentabarbital
olduğunu gösterir (Cihaz Dupont, Model 21-094)
Bilgisayar çıkışı sayısal veya grafiksel görüntüde olabilir.
Şekilde her iki görüntüye de birer örnek verilmiştir. Sayısal görüntüdeki tek
sayılı kolonlarda kütle sayıları artan bir sıraya göre dizilmişlerdir. Çift
sayılı kolonlardaki değerler, iyon akımlarının en büyük pike göre normalize
edilmiş değerleridir; en büyük pik 156 kütle numaralı tanecik için saptanmış ve
bu taneciğin akımı 1000 numara ile gösterilerek diğer pik yükseklikleri buna
göre hesaplanmıştır. Örneğin, 141 kütledeki pik, ana pikin %82.6 sı kadardır.
Bir kütle spektrometresinin kütleleri ayırabilme yeteneği,
m/Dm ile gösterilen rezolusyonu ile
ifade edilir. Buradaki m ve m+Dm, eşit
büyüklükte ve birbirinden tam olarak ayrılabilen iki taneciğin kütlelerini
gösterir.
%50 çukurluk: iki pik arasındaki minimum (çukurluk), pik
yüksekliğinin %50’sinden daha fazla değilse, pikler birbirinden ayrılabilir.
%10 çukurluk: iki pik arasındaki minimum (çukurluk), pik
yüksekliğinin %10’undan fazla olmamalıdır.
Rezolusyon
tanımları: (a) %10 ve %50 çukurluk, (b) FWHM
TOF (time of flight) kütle spektrometre için Dm, pik yüksekliğinin, yarısındaki pik
genişliği (full width at half maximum, FWHM) olarak tanımlanır: Dm = FWHM
Bu tanıma göre rezolusyon aşağıdaki formülle ifada edilir.
RS = 15 000 (FWHM)
Bir kütle spektrometrede istenilen rezolusyon onun kullanım
amacına bağlıdır. Örneğin, nominal kütleleri birbirine eşit olan, N2+
(28.006) ve CO+ (27.995) gibi iki taneciğin birbirinden
ayrılabilmesi için rezolusyonu birkaç bin olan bir cihaza gereksinim vardır.
Oysa, birbirinden 1 veya daha fazla kütle birimi kadar farklı düşük-molekül
ağırlıklı taneciklerin ayrılması için 50 den daha düşük bir rezolusyon
yeterlidir; NH3+ ve CH4+ nın
ayrılmasında olduğu gibi. Örneğin büyük parçalara bölünmesi durumunda birim
kütle farklılığındaki ayırmalar 250-500 rezolusyonlu bir spektrometre ile
çalışılabilir.
