Gaz-sıvı kromatografisi kimyasal sorunlardaki iki önemli
rolü ile değerlendirilebilir. Birincisi ayırma işlemlerinde
kullanılabilmesidir; ancak, karmaşık yapılı organik, metal-organik, ve
biyokimyasal sistemlerde başarılı değildir. İkinci rolü, bir analizin tam
olarak yapılabilmesidir. Alıkonma zamanları veya hacimleri kalitatif tanımlamalarda
kullanırken, pik yükseklikleri veya alanları da kantitatif tayine olanak verir.
Analitik bakımdan gaz-sıvı kromatografisi, bu bölümde görülen diğer bazı kromatografik
yöntemlere kıyasla daha sınırlı bir uygulama alanına sahiptir. Bu nedenle
gaz-sıvı kromatografisi cihazının, kütle, ultraviyole, infrared ve NMR
spektrometreler gibi daha üstün cihazlarla bir arada (birbirine bağlanarak)
kullanılması tercih edilmektedir.
Gaz-sıvı kromatografisinde kullanılabilecek yüzlerce sıvı
vardır. Benzer maddelerin bu yöntemle ayrılabilmesi için uygun bir sıvı seçimi
yapılmalıdır.
Bir maddenin alıkonma zamanı doğrudan doğruya onun dağılma
katsayısına bağlıdır, bu da sabit fazın yapısıyla ilişkilidir. Gaz-sıvı
kromatografisindeki sabit sıvı fazın örnekteki maddeler arasında farklı dağılma
katsayısı yaratması gerekir. Ayrıca, bu katsayının çok küçük veya çok büyük
olmaması da önemlidir. Dağılma katsayısı küçük olan maddeler kolondan çok hızlı
çıkarlar ve yeterli ayırma olmaz. Dağılma katsayısının gereğinden büyük olması
durumunda ise maddenin kolondan çıkması için gerekli zaman çok uzar.
Kolon içinde yeterli bir alıkonma zamanı, maddenin sabit faz
ile bir dereceye kadar uyumlu (çözünebilir) olmasıyla sağlanır. Bu ise madde
ile sabit fazın polaritelerinin kısmen benzer olmalarını gerektirir. Örneğin,
hidrokarbonlar veya eterler gibi polar olmayan bir homolog seri, squalane (yüksek
molekül ağırlıklı bir doğmuş hidrokarbon) gibi bir sabit sıvı faz ile
birbirinden ayrılabilir. Diğer yandan, alkoller ve aminler, polietilen glikol
gibi daha polar bir sıvı ile çalışılır. Aromatik hidrokarbonlar için ise
benzildifenil sabit sıvı fazı uygundur.
Polariteleri birbirine benzeyen maddeler çoğunlukla, kaynama
noktası sırasına göre ayrılırlar; kaynama noktası farkı artıkça ayrılma daha
iyi olur. Kaynama noktaları birbirine yakın, fakat polariteleri farklı olan
maddelerin ayrılması için, sabit sıvı fazın maddelerden birini (veya daha
fazlasını) dipol etkisiyle veya katılma ile tutması gerekir. Bu etkilerden
bazıları Tablo-8'de verilmiştir. Burada parafinik ve olefinik bir seri maddenin
alıkonma zamanları (etana göre) üç ayrı sıvı faz için kıyaslanmıştır. Birinci
sıvı faz triisobütilendir ve polar değildir; diğer ikisi polar sıvılardır.
Asetonil aseton, ayrıca, özel olefinlerle zayıf katılma reaksiyonları veren
gümüş nitrat içerir. Trisobütiledeki alıkonma zamanları, maddelerin kaynama noktaları
ile uyumluluk gösterir ve kaynama noktaları birbirine yakın olan maddeler için
aynı değerlerdir; ayrılma olmamıştır veya çok zayıftır. Asetonil aseton ise
orta derecede polar bir maddedir ve olefinlerde tesirle polarizasyon yapar;
maddelerin alıkonma zamanları birbirinden farklı olur. Polarize olamayan
parafinlerin alıkonma zamanları polar çözgende polar olmayan çözgendekine
kıyasla daha küçüktür. Olefinler ve gümüş nitrat arasında seçici olarak katılma
reaksiyonu olması da iyi bir ayırma sağlar; örneğin, isobüten ve büten-1 ilk
iki kolonda biribirinden ayrılamadığı halde üçüncü kolonda ayrılmışlardır. Cis-
ve trans-büten-2’de ayni kolonda daha iyi ayrılma göstermişlerdir.
Tablo-8:
Hidrokarbonların Çeşitli sabit Sıvılarla Ayrılması
Bileşik
|
Kaynama noktası 0C
|
Relatif alıkonma zamanı
|
||
Tri-izobütilen
|
Asetonil aseton
|
Glikolde AgNO3
|
||
Etan
|
-10.4
|
1.0
|
1.0
|
1.0
|
İzobütan
|
-11.7
|
5.6
|
2.2
|
0.75
|
İzobüten
|
-6.9
|
6.7
|
4.75
|
3.25
|
Büten-1
|
-6.3
|
6.7
|
4.75
|
6.25
|
Bütadien
|
-4.4
|
6.7
|
10.0
|
10.0
|
n-Bütan
|
-0.5
|
7.5
|
3.0
|
0.75
|
Trans-büten2
|
0.88
|
8.0
|
5.85
|
1.75
|
Cis-Büten-2
|
3.72
|
8.9
|
6.8
|
5.5
|
Tablo-9: Bazı Sabit
Fazlar
Adı
|
Kimyasal bileşim
|
Maks. sıcaklık
|
Polarite(a)
|
Ayırma tipi
|
Squalene
|
C30H62
|
150
|
NP
|
Hidrokarbonlar
|
OV-1
|
Polimetil
siloksan
|
350
|
NP
|
Genel
amaçlı, polar değil
|
DC
710
|
Polmetilfenil
siloksan
|
300
|
NP
|
Aromatikler
|
QF-1
|
Politrifluoropropil
metil siloksan
|
250
|
P
|
Amino
asitler, steroidler, azotlu bileşikler
|
XE-30
|
Polisiyanometil
siloksan
|
275
|
P
|
Alkaloidler,
halojenli bileşikler
|
Carbowax
20 M
|
Polietilen
glikol
|
250
|
P
|
Alkoller,
esterler, yağlar
|
DEG
adipat
|
Dietilen
glikol adipat
|
200
|
SP
|
Yağ
sitleri, esterler
|
Dinonil
ftalat
|
150
|
SP
|
Ketonlar,
eterler, S‘lü bileşikler
|
(a) NP: polar değil, SP: yarı
polar, P: polar
Seçicilik yapan diğer önemli bir etki de hidrojen bağı
oluşmasıdır. Böyle bir bağlanma için maddenin polar bir hidrojen atomu,
solventin de bir elektronegatif grup (oksijen, fluor veya azot) içermesi
gerekir (veya tersi). Bir grup maddenin bulunduğu bir örneğin analizi için
gerekli sabit fazın saptanmasında çeşitli yöntemler uygulanır. Bunlardan
birinde, sabit fazlardaki benzen, etanol, metiletil keton, nitrometan, ve
pridinin alıkonma indisleri, aynı solventlerin squalane üzerinde gösterdiği
alıkonma indisleri ile kıyaslanır. Sonuçta elde edilen verilerle, sabit fazlar
sınıflandırılır. Yine de bir ayırma işleminde kullanılacak sabit fazlar
arasında deneme ile en uygunu seçilmelidir. Tablo-9’da çok kullanılan bazı
sabit sıvı fazların listesi verilmiştir.
Sıvı-kromatografisi gibi gaz kromatografisi de karmaşık karşımları
ayırmada ve her bir maddenin tanımlanmasında kullanılan önemli bir yöntemdir.
Alıkonma Zamanı ve
Alıkonma Hacmi: Bir maddenin kalitatif analizi için tek bir alıkonma zamanı
yeterli değildir. Çünkü alıkonma zamanı kolon sıcaklığı, akış hızı, basınç, ve
sabit fazın yapısı gibi çalışma koşullarına göre değişir. Emin olmak için
analit ve standardın alıkonma zamanları, çalışma koşulları değiştirilerek
incelenir, her ikisindeki alıkonma zamanı benzer bir değişiklik gösteriyorsa,
analitin standart ile ayni madde olduğu söylenebilir. Veya, iki/üç ayrı kolonda
iki/üç farklı sıcaklıkta elde edilen alıkonma zamanlarının analit ve standart
için benzer olmaları da maddenin tanımlanması için yeterlidir. Bir karışımdaki
maddelerin birbirinden ayrıldıktan sonra tanımlanması, karışım halindeyken
tanımlanmasından daha kolaydır.
Daha önce de belirtildiği gibi kalitatif analizlerde
alıkonma hacmi, alıkonma zamanından daha iyi bir parametredir; çünkü sadece
analitin dağılma katsayısı, kolonun sıcaklığı ve sabit fazın yoğunluğuna
bağlıdır (denklem 6).
Bağıl (İzafi,
Relatif) Alıkonma Zamanı: Seçicilik faktörü a
bağıl alıkonma zamanının bir ölçüsüdür ve aşağıdaki formülle tarif edilir.
A analitinin bulunduğu bir örneğe B iç standartı ilave
edilerek a parametresi bulunur. A ve B
kimyasal olarak biribirinin benzeri maddeler olduğundan a kolon değişkenlerinden etkilenmez. A ve B'nin pikleri birbiri
üzerine düşmemeli ve her ikisi de birbiriyle ve hareketli fazla uyumlu olmalıdır.
Seçicilik faktörünün, sadece (tR)A , (tR)B
ve tM ölçümlerinden bulunabilme gibi bir avantajı vardır.
Alıkonma İndeksi: Alıkonma
indeksi (I) Kovats tarafından çıkarılmış bir parametredir; kromatografik
verilerin rapor edilmesinde kullanılır. Bir analitin alıkonma indeksi analit
pikini iki veya daha fazla normal parafin piki ile kıyaslayarak bulunur. Bir
normal parafinin alıkonma indeksi, içerdiği karbon atomları sayısının 100
katıdır ve kullanılan kolonlara veya
kromatografik koşullara bağımlı değildir. Buna göre n-pentanın alıkonma
indeksi, daima 500, n-oktanınki 800'dür.
Homolog bir seride bulunan maddelerin alıkonma zamanlarının
(veya hacimlerinin) logaritmaları t’R (t’R = tR
– tM) bu maddelerin içerdikleri karbon sayısı ile doğrusal bir
ilişki gösterir. Bunun sonucu olarak da n-parafinlerde (tR - tM) değerlerinin alıkonma zamanlarına göre
çizilen grafiği bir doğru verir. Buna göre X maddesinin alıkonma indeksi
aşağıdaki eşitlikle tarif edilir.
t’R, her madde için düzeltilmiş alıkonma
zamanıdır ve t’R = (tR - tM) ye eşittir. X
analiti, n ve (n+1) karbon sayısına gören-parafinleri belirtir. Hidrokarbonlar,
alıkonma süreleri analitin alıkonma süresini içine alacak şekilde seçilir.
Şekil-36:
Üç bileşiğin alıkonma indeksleri tayin önteminin grafikle tanımlanması; kararlı
faz: squalen, sıcaklık 60 0C
C4 –C9 n-Prafinler için çizilen grafik
Şekil-36'da görülmektedir. Üç bileşiğin aynı kolonda ve aynı sıcaklıktaki log
alıkonma zamanları da ordinatta gösterilmiştir. Alıkonma indeksleri, apsiste
karşılığı olan değerlerin 100 ile çarpılmasıyla bulunur: toluenin alıkonma
indeksi 749, benzeninki 644'dür.
Normal olarak, alıkonma indekslerinin tayininde grafik
yöntemine gereksinim olmaz. Bunun yerine, maddenin bulunduğu karışımın ve iki
normal parafin standardının kromatogramları kıyaslanır. Standartlardan birinin
alıkonma zamanı maddeninkinden daha düşük, diğerininki daha büyüktür.
Aşağıdaki verileri kullanarak 100 0C'de squalene
kolondaki benzenin alıkonma indeksini hesaplayınız.
Denklem(7)'de değerler yerine konur.
Alıkonma indeksi için geniş bir kaynama aralığını kapsayan
referans maddeler bulunması önemli bir avantajdır. Ayrıca alıkonma indeksinin
sıcaklığa bağımlılığı çok azdır. Polar ve polar olmayan sabit fazlar arasındaki
alıkonma indeksleri arasındaki fark (DI),
sabit fazların izafi polaritelerinin de bir ölçüsüdür.
Alıkonma Zamanı
Eğrileri: Kalitatif kromatografik çalışmalarda homolog serilerden yararlanılabilir.
Homolog bir seri bir diğerinden (farklı polaritede) kromatografik veya başka
bir yöntemle ayrılabilir ve standart olarak kullanılabilir; çünkü bir serinin
elemanları için log tR ile karbon sayısı arasında doğrusal bir
ilişki bulunur.
Diğer bir önemli ilişki de, örneğin polariteleri farklı iki
kolona injekte edilmesiyle bulunur. Yine homolog serilerle yapılan böyle bir
çalışmada böyle bir kolondan alınan alıkonma zamanlarının, diğer kolondan elde
edilen alıkonma zamanlarına (log. skalada) göre çizilen grafiği bir doğru verir
(Şekil-37).
Böylece, iki ayrı kolon kullanarak kaynama noktaları benzer
olan, fakat farklı polar özelliklerdeki maddelerin kromatogramları elde
edilebilir.
Şekil-37:
Çeşitli homolog serilerin iki kolondaki davranışları
Özet: Tek bir gaz
kromatogramı bir bileşiğin kesin olarak tanımlanmasını sağlayamaz. Ancak farklı
polaritelerdeki üç kolondan alınan benzer alıkonma indeks verileri ile analitin
hangi standarda benzediği teşhis edilebilir.
Uçucu maddelerin saflıkları gaz kromatogramlarından
kolaylıkla izlenebilir. Kirlilikler, ilave pikler oluşturarak kendilerini
gösterirler; bu piklerin altında kalan alanlar, kirliliğin miktarı hakkında
kabaca bir fikir verir. Bu yöntem saflaştırma işlemlerini kontrol etmekte de
kullanılır.
Bir gaz-sıvı kromatografi kolonundan alınan dedektör sinyali
kantitatif ve yarı kantitatif analizde kullanılır. Çok iyi kontrol edilen
koşullarda %1-3 kadar duyarlıkla tayin yapılabilir. Pek çok analitik yöntemde
olduğu gibi sonuçların doğruluğunda, kalibrasyon ve değişken parametrelerin
kontrolü çok önemlidir; örneğin yapısı da doğruluğu kısmen de olsa
etkileyebilir.
Sıcaklık programlı gaz kromatografisinde kolon sıcaklığı
sıyırma işlemi ile doğrusal olarak artar. Böyle bir işlem hızlı bir ayırmaya
olanak verir.
Şekil-38'de, normal parafin karışımlarının ayrılma ve
tanımlanmasında, sabit sıcaklıkta (izotermal) ve sıcaklık programlı
sistemlerden alınan kromatogramlar görülmektedir. İzotermal yöntemde, molekül
ağırlığı düşük olan maddeler birbirine çok yaklaşmış, yüksek molekül ağırlıklı
olanlar ise 95 dakika sonunda bile çıkamamışlardır. Ayrıca molekül ağırlığı
artıkça piklerin şekilleri bozulmuş ve kantitatif analize uygun şekillerden
sapmıştır.
Sıcaklık programlı çalışmalarda ise büyük molekül ağırlıklı
maddeler de dahil olmak üzere kromatogram kısa sürede tamamlanmış ve pik
konumları ve şekilleri düzgünlüğünü korumuşlardır.
Sıcaklık programlı cihazlarda sıcaklığı 0.25-20 0C/dak.
aralığında doğrusal olarak yükselten bir düzenek bulunur. Ayrıca, kolon
sıcaklığı sürekli olarak artarken
injeksiyon kısmı ile dedektörün sabit sıcaklıkta kalmasını sağlayacak
ayrı ısıtıcılara gereksinim vardır. Sabit akış hızı bir akış kontrol edici ile
sağlanır. Çünkü sıcaklık yükselmesi gaz viskozitesini ve kolon direncini
artırarak akış hızını düşürür. Akış hızındaki düşme taban çizgisinin kararsız
olmasına ve dedektör algılamasının değişmesine neden olur.
Algılama sistemlerin pek çoğu bir kolondan çıkan maddelerin
hepsi için ayni şekilde algılama (az veya çok) yaparlar; bunlar "seçici
olmayan" dedektörlerdir. "Seçici" veya
"özel(spesifik)" dedektörler kullanılarak gaz-sıvı kromatografisinin
ayırma gücü üstün analitik cihazlarla birleştirilebilir.
Uygulama iki şekilde yapılabilir. Birincisinde madde
buharları soğutulan bir tutucuda ayrı fraksiyonlar halinde toplanır; bu işlemde
maddeleri parçalamayan ve seçici olmayan bir dedektör kullanılır. Sonra bu
fraksiyonlar NMR, IR, kütle ve diğer spektroskopik yöntemlerle tanımlanır.
Buradaki en önemli sınırlama toplanan madde fraksiyonlarının çok az miktarlarda
(mikromolar) olmasıdır. Yine de yöntem pek çok karmaşık karışımların kalitatif
analizinde başarıyla kullanılabilmektedir.
İkinci uygulamada seçici bir dedektörle kolon akışı sürekli
olarak izlenir. Aşağıda bu uygulamalara dayanan bazı örnekler verilmiştir.
Şekil-38:
Bazı n-parafin kromatogramlarının kıyaslanması; Kolonlar: 100-200 meş Var Aport
30 üzerinde %3 apiezon, 20 feet uzunluk, 1/16 inç çap, akış hızı: 10 ml/dak.
Otomatik Titrasyon
Dedektörleri: James ve Martin ilk gaz kromatografik çalışmaları olan uçucu
yağ asitlerinin tayininde, dedektör olarak otomatik bir titrasyon hücresi
kullanmışlardır; ayni sistem daha sonra aromatik ve alifatik aminlere uygulanmıştır.
Bu yöntemde kolondan çıkan sıyırıcı, asit-baz indikatör çözeltisi içeren bir
hücreye gönderilir. Çözeltinin absorbansı fotometrik olarak izlenir ve hücreye
gelen madde (titrant) sürekli olarak ölçülür; harcanan titrant hacmi bir kağıt
üzerinde kaydedilir; hacim-zaman eğrisi çizilir. Bu eğriden kalitatif ve
kantitatif tayinler yapılır. Pestisid kalıntılarındaki çeşitli klorlu
bileşiklerin tayininde dedektör olarak kulometrik bir hücre kullanılır.
Gaz Kromatografisinin
Kütle Spektroskopisi ile Birleştirilmesi (GC/MS): Kromatografik kolonlar
kütle spektrofotometreler ile doğrudan bağlanabilir ve kolondan çıkan her bir
maddenin hemen spektrumu alınır. Bu cihazlar, çoğunlukla, bir bilgisayara da
bağlanır ve alınan her spektrum hafızada tutularak daha sonra kağıt üzerine
aktarılır. Bu tip cihazlar, doğal ve biyolojik sistemler içinde bulunan
yüzlerce maddenin tanımlanmasına olanak verir. Böyle bir sistem, örneğin, yiyeceklerdeki
koku ve tat analizlerinde hava kirliliği analizlerinde ve solunum hastalıkları
teşhisinde kullanılır.
Bir gaz kromatografisi ve kütle spektrofotometresi
birleşiminde karşılaşılan en önemli sorun ortamdaki taşıyıcı gazdır; taşıyıcı
gaz sıyrılan her maddenin seyrelmesine neden olur ve ayrıca spektrometrenin
pompalama sistemine de girer. Bu sıkıntılı durumu yenmek için çeşitli yöntemler
geliştirilmiştir; bunlardan biri Şekil-39'da görülmektedir. Burada çıkış
gazları vakum uygulanan bir odacığa yerleştirilmiş poröz bir cam tüp içinden
akıtılır. Taşıyıcı gazın (He veya H2) küçük atom veya molekülleri
tüpün cidarlarına difüzlenir ve pompalanarak dışarı atılır, böylece tüpte
sadece kolondan sıyrılan örnek kalır; bu akım sonra doğrudan kütle spektrometresinin
ion kaynağına gönderilir. Oluşan iyonik demet dört katlı veya küçük
çift-odaklayıcı bir spektrometre ile analiz edilir.
Son yıllarda "iyon tuzağı " (ITD) denilen bir
cihaz yapılmıştır. Bu cihazda iyonlar örnekten elektron çarpmasıyla yaratılır
ve bir radyo frekansı dalgalı alanda depolanır (Şekil-40). Tutulan iyonlar
sonra depo alanından çıkarılarak bir elektron çoklu dedektörüne gönderilir.
Çıkarma işlemi, kütle/yük oranına göre tarama yapılabilecek şekilde, kontrollü
olarak yapılır.
Şekil-39:
Gaz kormatografisi ve kütle spektrometresi arasındaki basınç düşürme sistemi
Şekil-40: İyon
tuzağı dedektörünün şematik görünümü
Kütle spektrometresi dedektörlerinin görüntüleri çeşitlidir
ve iki grupta toplanır: gerçek-zaman ve bilgisayar-incelemeli. Bu grupların her
birinde, toplam iyon akımı kromatogtogramları (tüm iyon akımlarının toplamının
zamana göre grafiği), seçilmiş iyon akımı kromatogramları (bir veya birkaç
iyonun iyon akımlarının zamana göre grafiği), ve çeşitli piklerin kütle
spektrası seçimi yapılır. Gerçek zaman kütle spektrası, üzerinde kütle
işaretleri bulunan bir osilaskop ekranında görüntülenir; kütle kromatogramı,
osilaskop ekranında görülebilir veya bir gerçek-zaman kaydedicide çizilebilir.
Bir ayırmanın tamamlanmasından sonra bilgisayar-dönüşümlü
kromatogramlar ekranda belirir veya kaydedicide kaydedilir. Her pikin
dönüştürülmüş kütle spektrası da görüntülenebilir veya kaydedilebilir. Bazı
cihazlarda, maddelerin tanımlanmasında kullanılan spektral kütüphaneler
bulunur.
Bir GC/MS uygulaması Şekil-41'de görülmektedir. Üstteki
şekil bir örneğin bir bilgisayar-incelemeli kütle spektrumudur. Burada ordinat
toplam iyon akımını, apsis alıkonma zamanını gösterir. Alttaki şekil
kromatogramdaki 12 numaralı pikin bilgisayar-incelemeli kütle spektrumudur.
Burada relatif iyon akımları kütle numarasına göre çizilmiştir.
Şekil-41:
Bir GC/MS cihazından alınan tipik bir karışımın, (a)GC kromatogram, (b) 12
numaralı pikin kütle sektrumu
İnfrared Spektroskopi
(IR) – Kromatografi: Kromatografik piklerin infrared spektralarının da
alınabildiği cihazlar geliştirilmiştir. Bunun için normal ve Fourier transform
infrared spektrometreler kullanılabilir. Çalışmada, kromatografi kolonundan
çıkan akım infraredgeçirgen pencerelerin bulunduğu uzun, dar bir tüp içine
gönderilir. Spektral veriler rakamlara dönüştürülerek bir bilgisayarda saklanır
ve sonra spektrumlar çizilir.
GC/MS’de olduğu gibi, kolon ve dedektör arasındaki bağlantı
önemlidir. Burada kolona, uzunluğu birkaç milimetre ile birkaç santimetre
arasında değişen ve iç çapı 1-3 mm olan bir ışık tüpü bağlanır. Işık tüpü iç
kısmı altınla kaplanmış bir pyreks tüptür (Şekil-42). Işık duvardan çok sayıda
yansıyarak geçer. Işık tüpü, örnekteki maddelerin yoğunlaşmasını önlemek
amacıyla ısıtılır. Bu tip ışık tüplerinin dizaynında, hassasiyetin
yükseltilmesi için geçiş yolunun en fazla, band genişliğinin azaltılması için
de ölü hacmin en az olmasına dikkat edilir. Işın dedektörleri, çok hassas, sıvı
azotla soğutulan civa-kadmiyum tellürdür.
Bir kolondan gelen gaz akımının spektrumlarının, cihazın
kütüphanesinde bulunan ve katı veya sıvı örneklerden hazırlanan spektrumlarla
kıyaslanmasında bazı zorluklarla karşılaşılabilir. Çünkü gaz halindeki
maddelerin spektrumları çok ince bir yapı gösteriler, oysa sıvı ve katı
maddelerin spektrumlarında böyle bir durum gözlenmez; tabi ayni maddelerin gaz
ve sıvı (veya katı) halinin infrared spektrumları da birbirinden önemli derecede
farklı olur.
Şekil-42:
GC/IR cihazlarında kullanılan tipik bir ışık tüpü
