Elektroforez, bir elektrik alanının etkisi altında bulunan
bir çözeltideki taneciklerin göç etmesi şeklinde tarif edilir. Eskiden, bu
taneciklerin kolloidal oldukları ve adsorbladıkları iyonlar nedeniyle yüklü
hale geldikleri kabul edilirdi. Böyle bir tanımlama bugün için fazla bağlayıcı
bulunmaktadır ve elektroforez terimi iyonlara da kolloidal taneciklere de
uygulanabilen bir tanım olarak kabul edilmektedir. Elektroforetik yöntemlerle
bir karışımdaki maddeler, agregatlar (yapışık veya bir arada toplanmış gruplar)
halinde veya tek tek ayrılabilir.
Elektroforetik yöntemler ayırma işleminin, bir destek veya
sabitleyici ortamın bulunmadığı hallerde yapılmasına göre iki gruba ayrılır.
"Serbest-çözelti" yönteminde örnek çözeltisi, bir tampon sıvı ile
doldurulmuş U-tüpünün tabanına topluca konulur. Tüp uçlarının yakınına
yerleştirilen elektrotlarla bir elektrik alanı uygulanır; yüklenen taneciklerin
farklı hızlarla elektrotlardan birine veya diğerine doğru hareket ettikleri
gözlenir. Farklı göç hızları sonucunda ayrılma olur; bu hızlar, ortamdaki
taneciklerin yük/kütle oranları ile yapısal hareketliliklerine de bağlıdır.
Serbest-çözelti yöntemi, Tiselius tarafından geliştirilmiş ve proteinlerin
ayrılmasında kullanılmıştır; bu çalışmasıyla Tiselius 1948 Nobel ödülünü
kazanmıştır. Yöntem, biyokimyanın gelişmesinde bir başlangıç olmuştur; ancak
bazı deneysel sorunlar nedeniyle geniş bir uygulama alanına yayılamamıştır. Bu
sorunlar ayrılan maddelerin, konveksiyonla, yoğunlukla ve mekanik titreşimlerle
birbirine karışma eğilimlerinden kaynaklanmaktadır. Ayrıca ayrılan madde
bandlarını saptayacak çok hassas optik sistemlere de gereksinim vardır.
Ayırma işleminin bir kağıt, çok ince bir katı tabaka veya
uygun bir katı madde ile doldurulmuş bir kolon gibi sabitleyici bir ortamda
yapılması halinde, serbest-çözeltili elektroforez işlemlerinde karşılaşan pek
çok sorun giderilebilir. Bu yöntemde, daha önce anlatılmış olan çeşitli
kromatografik yöntemlere ilave olarak elektrik alanı bulunur. Ortamın
özelliklerine bağlı olarak ayırma, elektroforetik etkiler sonucunda veya
elektroforez ile adsorbsiyon, iyon-değiştirme, veya diğer dağılma dengelerinin
birleşimi sonucunda oluşur. Sabitleyici bir ortamdaki elektroforeze dayanan
ayırma yöntemlerine çeşitli adlar verilir; bunlar, elektrokromatografi, sınır
elektroforezi, elektrogöç ve iyonoforez' dir. Burada anlatılan elektrokromatografi'
dir.
Elektrokromatografide kullanılan katı ortamlar çok ve çeşitlidir. Kağıt, selüloz asetat membranlar, selüloz tozlar, nişasta jelleri, iyon değiştirici reçineler, cam tozları, ve agar jelleri örnek olarak sayılabilir. Katının fiziksel yapısına bağlı olarak ayırma işlemleri kağıt şeritler, membranlar, kolonlar, tepsiler, cam veya plastikle desteklenmiş ince tabakalarda yapılabilir. Bazı dezavantajları olmasına karşın filtre kağıdı ve selüloz asetat en fazla kullanılan sabitleştiricilerdir.
Şekil-28'de kağıt elektroferezinde uygulanan yöntemlerden
üçünün şematik diyagramı görülmektedir.
Şekil-28(a)’daki yöntemde bir kağıt şerit, tampon bir karışımla doldurulmuş iki
kap arasına yatay olarak yerleştirilmiş ve uçları tampon çözeltilere
daldırılmıştır. Buharlaşma olmaması için cihaz hava-geçirmez bir sistem içinde
bulundurulur. Örnek şeritin merkezine toplu olarak konur ve iki elektrod
arasına 100-1000 V aralığında bir doğru akım uygulanır. Elektrod
reaksiyonlarının kağıttaki tamponun bileşimini değiştirmemesi için, elektrodlar
izole edilir. Miliamper seviyelerinde akımlar gözlenir. Uygun bir elektroliz
periodu sonunda kağıt çıkarılır, kurutulur ve kolorimetrik maddelerle oluşan
bandlar tanımlanır.
Şekil-28(b)'de ters-V biçiminde bir düzen görülmektedir.
Burada örnek V' nin tepe noktasına konur; katyonik tanecikler V'nin bir kolundan,
anyonik olanlar da diğer kolundan akarlar.
Şekil-28(c)'deki cihaz ise iki-yönlü elektrokromatografi
yöntemine göre çalışır. Levha şeklindeki kağıt dikey olarak yerleştirilmiştir;
örnek tamponlanmış bir çözgenle levhadan aşağı doğru taşınır. Hareketli ve
sabit fazlar arasındaki dağılma farklılığı sonucunda dik yönde ayrılma oluşur.
Ayrıca, çözeltinin akış yönüne dik yönde uygulanan bir elektrik akımı ile yatay
eksen boyunca da değişik hızlarda elektrogöç olur. Böylece örnekteki maddeler,
örneğin verildiği noktadan başlayan radyal birer yol boyunca birbirlerinden
ayrılırlar.
Şekil-28(c)'deki yöntem hem analitik hem de preparatif
uygulamalarda kullanılmaktadır. Analitik uygulamalarda kağıdın alabileceği
kadar tampon çözelti kullanılır; deney sonunda kağıt çıkarılır, kurutulur ve
tanımlama çözeltileri uygulanır. Preparatif uygulamalarda ise tampon çözeltinin
akışı sürdürülerek her madde tüpler içinde toplanır.
Şekil-28:
Kağıt kromatografisinde kullanılan bazı cihaz tipleri
Elektrokromatografik analiz yöntemleri, çok çeşitli biyolojik maddeleri ayırmak zorunda olan biyokimyacılar ve klinik kimyacıları için çok önemlidir. En çok kullanım yeri klinik teşhislerdir; proteinler, serum, urin, miğde suyu ve diğer vücut sularındaki büyük moleküller elektrokromatografi ile ayrılabilir. Elektrokromatografi, alkaloidler, antibiyotikler, nükleik asitler, vitaminler, doğal pigmentler, steroidler, aminoasitler, karbohidratlar ve organik asitler gibi küçük moleküllerin ayrılmasında da kullanılır.
İnorganik iyonların ayrılmasında da elektrokromatografi
önemli bir cihazdır. Şekil-29(a)'da bir kompleksten altı metal iyonunun
ayrılması görülmektedir. Kompleks iyonun yüküne bağlı olarak anodik veya
katodik göçmeler olmuştur. Ayrıca nikel(2) iyonunun hareketi, dimetilglioksim
çökeleği ile geciktirilmiştir.
Şekil-29(b)'de örnekdeki maddelerin, sürekli elektroforez ve
sıyırma işlemi sırasında izledikleri yol gösterilmiştir. Kağıdın taban kısmına
konulan uygun kaplar içinde her fraksiyon ayrı ayrı toplanabilir.
Şekil-29:
İnorganik iyonların elektrokromatogramları; (a) Katyonlar (0.05 M), 0.1 M
tartarik asit içinde, yıkama sıvısı: 0.01 M amonyum tartarat, 0.05 M dimetil
glioksimde ve 4 M amonyakta karışımı; (b) sürekli ayırma, çözeltie her biri
0.05 M olan As(III), Sb(III) ve Sn(III) iyonları ile 0.02 M tartarik asit0.04 M
laktik asit ve 0.04 M l-alanin vardır
