Kütle spektral ölçümlerinin ilkeleri basittir ve kolay
anlaşılır, fakat enstrumantasyonu oldukça karmaşıktır. Yüksek resolusyonlu
kütle spektrometresi çok pahalı, elektronik ve mekanik bir cihazdır, işletim ve
bakım masrafları da oldukça fazladır.
Şekil-1'de bir kütle spektrometresinin temel kısımları, Şekil-2'de
tipik bir analitik kütle spektrometresi şematik olarak gösterilmiştir.
Şekil-1: Bir
kütle spektrometrenin temel kısımları
Şekil-2: Bir
kütle spektrometrenin şematik diyagramı
Kütle spektrometresi ile çalışmalarda sistemin vakum altına
tutulması gerekir; bunun temel nedeni ortalama–serbest yolu yükseltmektir.
Ortalama mesafe, iyonize moleküllerin, diğer iyon ve moleküllerle
çarpışmalarından önceki yolculuğu olarak tanımlanır; yüksek bir
ortalama-serbest yol, tekrarlanabilir faragmantasyon sağlar ki bu da yüksek
hassasiyet ve güvenilir bir kütle analizi yapılmasına olanak verir.
Ortalama-serbest yol, iyonizasyon kaynağı ve iyon dedektörü arasındaki
mesafeden daha büyük olmalıdır.
Vakum, iki kademeli vakum sistemiyle sağlanır: Birincisi,
bir rotary pompadır; bu kaba veya ön pompadır; 10-2 -10-4
torr vakum sağlar. İkinci pompa bir turbomoleküler veya bir difüzyon pompası
olabilir; vakum 10-5 torr değere ulaşır. Bu pompalar kompresörler
gibi çalışır.
Turbomoleküler
Pompa: Turbomoleküler
pompada bir dizi bıçak veya kanat bulunur; bunlar 30 000-90 000 rpm hızla
dönerken etraftaki gaz moleküllerini aşağı ve dışarı atarlar. Bir turbo pompa
birkaç saat içinde temiz bir vakum ortamı sağlar. Ancak kullanım süresi kısadır
(1-2 yıl) ve gürültülü çalışır.
Yağ
Difüzyon Pompası: Yüksek
vakum elde etmek için kullanılan, 4-kademeli bir pompa türüdür. Yağ ısıtılır ve
bacalardan (1, 2, 3) yükselir, tepeye ulaştığında her bir bacanın üst kısmında
bulunan deliklerden püskürür; püsküren her bir tanecik çevresine bulunan gaz
moleküllerini toplar ve aşağıya doğru ittirir. Dördüncü ve son kademede yağ
damlaları bir pompayla toplanır ve tekrar devreye gönderilir. Bu tür pompaların
bakımı kolaydır, ancak yüksek vakuma ulaşmak zaman alır. Ayrıca, iyi dizayn
edilmemişse deney örneğine yağ kaçma olasılığı vardır.
2. Örnek Verme
Sistemi
Örnek verme sisteminin amacı, bir örneğin düşük basınçta gaz
halinde iyon kaynağına gönderilmesidir. Örneğin fiziksel haline göre giriş
sisteminin yapısı da farklı olur; her tipteki örnek düşünüldüğünde birkaç sistemin
olması gerekir.
(a) Yığın (Batch)
Girişi: En çok uygulanan örnek hali gazdır ve bunun için 1-5 litrelik gaz
rezervuarları kullanılır (Şekil-4). Rezervuardaki gazın basıncı, iyonizasyon
odacığının basıncının bir veya ikinci derecesi kadar daha yüksektir, böylece
odacığa ince bir delikten sürekli ve kararlı bir örnek akımı sağlanır; örnek
basınçları için 0.01 torr tipik bir değerdir. 150 0C'nin altında
kaynayan sıvı örneklerle çalışıldığında, uygun bir miktar alınarak oda
sıcaklığında, havası boşaltılmış bir rezervuarda gazlaştırılır. Daha az uçucu
örnekler durumunda, maddenin ısıl olarak kararlı hale gelmesi için, örnek ve
rezervuar ısıtılabilir. Aksi halde, örneğin özel bir cihaz ile doğrudan
iyonizasyon odacığına verilmesi gerekir.
Tablo-1:
Örnek Verme Sistemleri
Örnek verme sistemi
|
Örnek tipi
|
Örnek miktarı
|
Özellikler
|
İyonlaşma metodu
|
Yığın (batch)
|
gaz, sıvı, düşük erime
noktalı katı
|
<1 mg
|
örnek akışı kararlıdır,
uzun süreli
|
EI, CI
|
Direkt prob giriş
|
az uçucu örnek
|
<1mg
|
örnek akışı prob sıcaklığına
göre değişir
|
EI, CI, DI
|
Membran
|
karışım çözelti
|
<10-6 M
|
sadece buharlar
|
EI, CI
|
GC, SFC
|
karışım çözelti
|
<1mg
|
çok uçucu bileşikler
|
EI, CI
|
LC, CZE
|
karışım çözelti
|
<1mg
|
az uçucu bileşikler
|
SI
|
SFC: supercrytical fluid chromatography, CZE: capillary
zone electrophoresis
Şekil-4: Bir yığın (batch) giriş sistemi
şematik görünüşü
(b) Doğrudan Örnek Buharı Girişi (Direct
Vapor Inlet): Doğrudan
buhar girişi, en basit örnek verme tekniğidir. Gaz halindeki analit bir iğne
valfle, kütle spektrometresinin kaynak bölgesine verilir. Örnekte bulunabilecek
hava pompa çıkış hatlarıyla uzaklaştırılır. Bu tip örnek verme tekniği gazlar,
sıvılar ve yüksek buhar basınçlı katılar için uygundur. Düşük buhar basınçlı
örnekler için, örnek önceden ısıtılarak buhar basıncı yükseltilir. Yöntem,
kararlı bileşiklere uygun olduğundan ve makul sıcaklıklara izin verdiğinden çok
sayıda örneğe uygulanamaz.
(c) Direkt
Prob, DIP (Direct Insertion Probe): DIP tekniği, buhar basıncı düşük olan sıvılar ve katıların kütle
spektrometresine verilmesinde kullanılan bir yöntemdir. İşlemde, örnek,
ısıtılmış bir kovanın ucundaki kısa bir kapiler tüpe yüklenir. Kovan, bir vakum
kanalıyla kaynak bölgesine gönderilir. Probun gerekli konuma ayarlanmasından
sonra kapiler tüpün sıcaklığı, örneğin buharlaşmasını sağlayacak bir seviyeye
kadar yükseltilir. Bu prob, direkt buhar girişiyle uygulanabilen sıcaklıklardan
daha yüksek sıcaklıklarda çalışmaya olanak sağlar. Ayrıca. Örnek vakum
atındadır, ve kaynağa çok yakın bir konumdadır; bu durum analizin daha düşük
sıcaklıklarda yapılmasını sağlar. Düşük sıcaklıkta analiz, sıcaklığa karşı
hassas bileşikler için çok önemlidir.
(d) Gaz
Kromatografisi Giriş Sistemleri: Bir kütle spektrometreye örnek verme
işleminde uygulanan en popüler teknik gaz kromatografisidir. Kompleks
karışımlar önce gaz kromatografisi ile ayrılır, her bir bileşenin tanımlanması
ve miktarlarının saptanması için kütle spektrometresine verilir. Bu iki cihazı
(GC-MS) birbirine bağlamak için çeşitli arayüz (interface) dizaynları
kullanılmaktadır. Girişlerin en önemli karakteristiğini, kütle spektrometreye
giren GC taşıyıcı gazın ve analitin miktarlarının ayarlanması oluşturur.
Taşıyıcı gazın fazla olması kaynak bölgesinin basıncının artmasına neden olur.
Bu durumda bölgenin gerekli basıncının devam ettirilmesi için daha büyük ve
güçlü vakum pompasına ihtiyaç doğar (ki bu çok pahalıdır). Kütle spektrometreye
giren analit miktarı, cihazın algılama sisteminin geliştirilmesi (dedektör)
yönünden önemlidir. İdeal hal, kütle spektrometrenin kaynak bölgesine taşıyıcı
gaz girmesine izin vermemek ve fakat analitin tamamının girmesini sağlamaktır.
GC/MS arayüzler çok çeşitlidir; moleküler separatör,
permeasyon seperatör, açık slit ve kapiler giriş kullanım alanları fazla olan
bazı arayüzlerdir. (Şekil-6)
Moleküler
Separatör: Gaz
kromatografisinde özellikle dolgulu kolonlar kullanılması durumunda
yararlanılan çok popüler bir sistemdir; çalışma prensibi relatif difüzyon
hızına dayanır: Küçük moleküllerin difüzyonu daha hızlı olduğundan, pek çoğu,
kütle spektrometrenin giriş jetini yakalayamaz; oysa daha büyük moleküller daha
yavaş difüzlendiğinden MS giriş jetine ulaşma şansları çok yüksek olur.
Geçirgenlik
(Permeation interface): Bu tip bir sistemde, GC ve kütle spektrometresi arasında
yarı-geçirgen bir membran bulunur. Bu teknikte karşılaşılan sorunlar arasında:
örneğin molekül ağırlığı ve polaritesine bağlı olarak membran seçiminin farklı
olması, algılamanın yavaşlığı ve membrandan analitin sadece az bir miktarının
geçebilmesi sayılabilir.
Açık
Split (Open split interface): Bu arayüzde kütle spektrometresine verilen akım, kapiler kolon
çıkışlarında olduğu gibi, genellikle ~1 mL/dak ile sınırlandırılmıştır; bunun
üstünde akım geldiğinde akımın fazlası atılır. Açık split arayüz herhangi bir
gaz üretin sisteminde kullanılabilir, ancak split sırasında örneğin de dışarı
atılması gibi bir dezavantajı vardır.
Kapiler
Girişi (Capillary Direct Interface): GC cihazında sadece kapiler kolon kullanılması halinde, kolon
çıkışının tümüyle kütle spektrometresine verilmesi sistemine göre çalışan bir
arayüzdür.
Şekil-6: Bazı tipik gaz kromatografisi giriş sistemleri
(e) Sıvı
Kromatografisi Giriş Sistemleri: Bir kütle spektrometreye az uçucu bileşikler için örnek verme
işleminde uygulanan tekniklerden biri de sıvı kromatografisidir. Kompleks
karışımlar önce sıvı kromatografisi ile ayrılır, her bir bileşenin tanımlanması
ve miktarlarının saptanması için kütle spektrometresine verilir. LC-MS
sistemlerini birbirine bağlamak için, GC-MS sistemlerinde olduğu gibi çeşitli
arayüzler (interface) kullanılmaktadır (Şekil-7).
Doğrudan
Giriş (Direct Inlet):
Bu teknikte sıvı kromatografi cihazından gelen akımın bir kısmı, bir
orifisten (çapı ~2.5 mm) doğrudan injekte edilir. İnjektörden basınçla çıkan
sıvı ince spreyler halinde dağılır, damlalar ısıtılan bir odacıkta buharlaştırılarak
çözgeninden kurtulur ve sonra iyonizasyon odacığına girer.
Termosprey: Termosprey arayüz doğrudan giriş
sisteminin doğal bir uzantısı gibi düşünülebilir; giriş tüpünü ucu uygun bir
sıcaklığa ısıtılarak örnek damlacıklarının buharlaşması kolaylaştırılır.
Optimum arayüz sıcaklığı hareketli fazın bileşimine bağlıdır.
Şekil-7: Bazı tipik sıvı kromatografisi giriş
sistemleri
Tanecik Demeti (Particle
Beam): Sürekli
(continue) bir örnek giriş sistemidir. Sıvı birkaç mikron çapında damlacıklar
halinde atomize edilir ve solventin büyük bir kısmı buharlaşıncaya kadar
ısıtılır. Tanecikler, püskürtmeyle buharlaştırılarak kütle spektrometrenin
iyonizasyon bölgesine gönderilir.
Elektrosprey: Elektrosprey arayüz atmosfer
basıncında çalışır; bu özelliği nedeniyle vakum altında (1-10 torr) çalışan
termosprey tekniğinden ayrılır. Örnek çözeltisi, iyon orifisinden 1 cm kadar
mesafedeki paslanmaz çelik bir kapilerin ucundan (jet) püskürtülür. Orifis
levhası ve jet arasına uygulanan 3-5kV potansiyel damlacıkların iyonlaşmasını
sağlar. Elektrospreyin iyonlaşma verimi iyonizasyon potansiyeline bağlı olarak
değişir. Potansiyel farkının artırılması başlangıçta damlacık boyutunu
yükseltir, ancak iyon oluşması gerçekleşemez. Ancak voltajın daha fazla
yükseltilmesi halinde sisle kaplanan tanecikler yüklenir ve iyonlaşırlar.
3. İyon Kaynakları
Molekülleri gaz iyonlar şekline dönüştüren çok sayıda yöntem
vardır; bunların çoğu da kütle spektrometresinde uygulanan yöntemlerdir.
Uçucu bileşikler
için: Elektron Impact İyonizasyon (EI), (b) Kimyasal İyonizasyon (CI):
Pozitif kimyasal iyonizasyon (PCI), ve negatif kimyasal iyonizasyon (NCI)
kaynaklardır. Uçucu olmayan bileşikler
için (c) Hızlı Atom Bombardımanı (FAB); Atmosferik Basınç İyonizasyon
(API); MALDI.
(a) Elektron Çarpma
(Impact) Kaynağı (EI): Elektron iyonizasyon yöntemine, elektron impact
iyonizasyon da denir; “sert” iyonizasyon tekniğidir, 10-5 torr
yüksek vakum altında çalışılır. GC-MS bağlantılı sistemlerde kullanımı oldukça
yaygındır. Şekil-8, tipik bir elektron "iyon tabancası"nın şematik
diyagramını göstermektedir. Elektron çarpması ile üretilen pozitif iyonlar, ilk
hızlandırma levhası ve repeller (uzaklaştırıcı) arasındaki küçük bir potansiyel
farkı ile levhanın slitinden geçerler. Birinci ve ikinci hızlandırıcılar arasındaki
potansiyel yüksektir, burada tanecikler son hızlarına erişirler; üçüncü slit
(odak sliti) demetin daha iyi paralel hale gelmesini sağlar. Spektrometrelerin
çoğunda, hızlandırıcı slitler arasına uygulanan potansiyelle belirli kütledeki
taneciklerin kollektör üzerinde odaklanması sağlanır.
Analiz edilecek örnek, doğrudan bir giriş yoluyla veya gaz
kromatografi kolonundan iyon kaynağı içine verilir. Isıtılmış tungsten veya
renyum gibi bir flamentten üretilen bir elektron demeti gaz halindeki örnek
molekülleriyle çarpışır, bir elektron bırakır ve pozitif yüklü bir iyon üretir;
iyon, örneğin relatif kütlesini gösterir.
Şekil-8: Bir iyon
kaynağı
Isıtılan
bir flamentten çıkan elektronlar, bir potansiyel farkıyla hızlandırılarak örnek
odacığına gönderilir. Örnek molekülü, bir elektron kaybederek iyonlaşır ve çiftleşmemiş
bir elektron içeren pozitif yüklü iyon haline dönüşür.
Elektron çarpma kaynağı, molekülleri çeşitli kütlelerde çok
sayıda pozitif iyonlara bölebilecek yeterli enerjiye sahiptir. Maddenin
tanımlanması alınan karmaşık spektrumdan doğru olarak yapılabilir.
(b) Kimyasal
İyonizasyon Kaynağı: Elektron iyonizasyondan daha “yumuşak” bir iyonizasyon
tekniğidir; fragman sayısı daha azdır. Pozitif ve negatif iyon şekilleri
vardır.
Kimyasal bir iyonisazyon kaynağında metan gibi bir reaktif
gaz, 1 torr kadar basınçta, özel bir elektron demeti kaynağı içine konulur.
Aynı kaynak içine, konsantrasyonu reaktifin 10-3 –10-4
katı olacak şekilde örnek ilave edilir. Örnek moleküllerinin elektronlar yerine
reagent iyonları ile çarpışması sonucunda iyonlaşma meydana gelir. Başlangıçta,
elektron demeti reaktif gaz ile etkileşerek CH5+ , CH4+
, CH2+, H2+, ve C2H5+
gibi çok sayıda iyon oluşturur.
CH4 + e- ¾® CH4+· + 2e- ¾® CH3+· + H
CH4+· + CH4 ¾® CH5+ + CH3·
CH4+· + CH4 ¾® C2H5+ + H2
+ H·
Bu iyonlardan birkaçı (CH5+ gibi),
kuvvetli proton vericidir ve analit molekülleri ile reaksiyona girerek kütlesi
bir birim daha büyük (M+1) iyonlar meydana getirirler. Örneğin, aşağıdaki
realsiyonla, MH analitinden MH2+ iyonu oluşur.
CH5+ + MH ¾® MH2+ + CH4
Bu tür iyonizasyonda, çoğunlukla, kimyasal iyonizasyon
kaynağı analitten çok az cins iyon üretir, bu nedenle de kütle spektrumu
basittir ve kolaylıkla tanımlanabilir.
Reaktif gaz izobütan
olduğunda,
i-C4H10 +
e- ¾® i-C4H10+· + 2e-
i-C4H10+· + i-C4H10
¾® i-C4H9+
+ C4H9 +H2
Reaktif gaz olarak amonyak da kullanılabilir (102
torr).
70 eV
NH3 + e- ¾¾® NH3+· + 2e-
NH3+· + NH3 ¾¾®
NH4+ + NH2·
NH4+
+ NH3 ¾¾® N2H7+
Kimyasal iyonizasyonda spektrometrenin iyon kaynağı, yüksek
basınçta tutulur.
Pozitif kimyasal iyonizasyon (PCI) işleminde proton transfer
reaksiyonuyla kuvvetli moleküler iyon [analit–H]+ meydana gelirken,
negatif kimyasal iyonizasyon işleminde (NCI) [analit-·]
kuvvetli moleküler iyon oluşumuyla sonuçlanan elektron yakalama reaksiyonu
geçekleşir.
NH4+ +
analit ¾¾® [analit – H]+ +
NH3
e- + analit ¾¾® analit-·
Proton transfer reaksiyonu için analiz edilen bileşik bir
proton alabilmelidir; aminler ve alkoller gibi. Elektron yakalama reaksiyonunun
oluşabilmesi için ise, bileşiğin bir elektron alabilme özelliğinde olması
gerekir; örneğin, F, Cl, Br, I gibi elektronegatif atomlar ve fenil halkası
(veyahalkaları) içeren konjuge sistemler bu özelliktedir. İyonizasyon tekniği
uygulanırken bileşiğin yapısına göre teknik seçimi yapılmalıdır.
Tablo-2: Bazı
Reaktif Gazlar ve Özellikleri
Reaktant
|
Analit
|
||
Gaz
|
İyonlar
|
Nötral iyon
|
İyonları
|
H2
|
H3+
|
H2
|
[M+H]+, [M-H]+
|
CH4
|
CH5+, C2H5+ ve C3H5+
|
CH4
|
[M+H]+, [M+C2H5]+ ve [M+C3H5]+
|
i-C4H10
|
t-C4H9+
|
t-C4H8
|
[M+H]+, [M+C4H9]+, [M+C3H3]+,
[M+C3H5]+ , [M+C3H7]+
|
NH3
|
NH4+
|
NH3
|
[M+H]+, [M+NH4]+
|
(c) Kıvılcım Kaynağı:
Metaller, yarı iletkenler, ve mineraller gibi uçucu olmayan inorganik
örnekler bir kıvılcım kaynağı ile iyonlaştırılabilirler. Burada elektron kaynağı
yerine, bir radyo frekanslı kıvılcım kaynağı. Örnek, elektrot (bir veya iki) olarak
kullanılır; veya, grafit ile karıştırılarak bir elektrotun üzerine kaplanır.
Elektrotlar arasına 30 KV kadar bir radyo-frekansı uygulandığında örnek gaz
halinde iyonik bir plazma şeklinde buharlaşır. Plazmadaki iyonlar uygun bir
doğru akım potansiyeli ile hızlandırılarak analizöre gönderilir.
(d) Alan İyonizasyon
Kaynakları: Bunlarda keskin bir bıçak şeklinde, veya bir veya daha çok
sayıda ince uçlar (mesela birbirinden 20 mm
aralıklı 1000 uç olabilir) biçiminde metalik bir anot ile, slit görevi yapan
bir katot bulunur; anot ve katot arasında 0.5-2 mm kadar mesafe vardır. 5-20
KV'luk bir potansiyel uygulandığında anotla temas eden gaz halindeki organik
madde 108 V/cm gibi büyük bir elektrik alanı ile karşılaşarak
iyonlaşır. Alan iyonizasyon tekniğinde, çoğunlukla, M+1 iyonu
oluşur, yani maddenin bölünmesi en düşük düzeydedir. Yapısal analizlerde alan
iyonizasyonu veya kimyasal iyonizasyon ile elektron çarpma kaynağı tekniği
birarada kullanılır; kimyasal veya alan iyonizasyonundan maddenin molekül ağırlığı
hakkında bilgi edinilirken, elektron çarpma kaynağının verdiği gruplardan
maddenin yapısı aydınlatılır.
(e) Hızlı Atom
Bombardımanı (FAB) ve Sıvı İkincil İyon Kütle Spektrometresi (LSIMS): FAB’da
kullanılan tanecik demeti, nötral bir inert gazdır; 4-10 kV ‘da Ar, Xe gibi.
LSIMS’de ise tanecik demeti iyonlardır; genellikle 2-30 keV’de Cs+
kullanılır. Her iki metot da “yumuşak” iyonizasyon metodudur; iyonların
çıkışından sonra çok az kalıntı enerji kalır. Bu nedenle uçuculuğu düşük olan
moleküllerin analizlerinde çok uygundur.
FAB ve LSIMS teknikleri birbirlerine çık benzer; ikisinde de
örnek probunun ucunda analit/matris karışımının katı noktaları, hızlı tanecik
demetiyle bombardıman edilir. Matris, gliserin veya 3-nitro benzil alkol gibi
küçük bir organik moleküldür; amacı, örnek yüzeyini homojen tutmaktır.
Analit/matriks yüzeyi üstüne giren tanecik demeti lokalize çarpışmalarla
enerjisini transfer eder; bu işlemde yüzeyden bazı ikincil iyonlar çıkar.
Bunlar ekstrakt edilir ve kütle spektrometreye gönderilmeden önce odaklanır.Üretilen iyonların polaritesi
kaynak potansiyeline bağlıdır. Şekil-9, bir pozitif iyon demeti oluşumunu
göstermektedir. Elde edilen spektrada önemli miktarda [M+H]+ and [M+Na]+ gibi,
bozulmamış moleküler tanecikler bulunur, yapısal parçalanma çok azdır.
Spektranın düşük kütle bölgesinde, gene de matris ve matris/tuz küme iyonları
vardır.
Şekil-9: FAB ve LSIMS
kütle spektrometrenin mekanizması
(f).
Atmosferik Basınç İyonizasyon (API): API yöntemi, özellikle sıvı kromatografisi-kütle spektrometresi
(LC/MS) sistemi için kullanım alanı çok yaygın olan bir iyonizasyon tekniğidir;
iyonizasyon vakum sisteminin dışında meydana gelir. Örneğin çözelti halinde
olması gerekir. İki tip API vardır: Elektrosprey iyonizasyon (ES) (Şekil-10) ve
atmosferik basınç kimyasal iyonizasyon (APCI) (Şekil-11).
Elektrosprey
İyonizasyon (ESI):
Elektrosprey iyonizasyon ESI, ES, IS kodlarıyla tanımlanabilir; ayrıca,
iyon sprey, nanosprey, sonik sprey ve saf elektrosprey de denilmektedir. En
yumuşak iyonizasyon tekniğidir. Polar ve uçucu olmayan bileşikler için ideal
bir iyonizasyon yöntemidir; bunlar arasında, proteinler, peptitler, nükleik
asitler, farmasetikler ve doğal ürünler sayılabilir. Sıvı kromatografi ile birleşik
olarak kullanılabilir. Yüklü buhar damlacıklarından gaz faza geçen iyonlar M+H+
veya M - H- iyonları üretir. Çok yüklü iyonlar da üretebilmesi yüksek molekül
ağırlıklı proteinlerin analizine olanak verir.
ESI kaynak, yüksek voltaj (4.5 kV) uygulanabilen çok ince
bir iğne içerir; örnek çözeltisi bu iğne içinden kaynak odacığına püskürtülür,
ve damlacıklar halinde dağıtılır. Damlacıklar kapilerden çıkarken yüklüdürler;
solvent buharlaşırken yüklü analit moleküllerini bırakırlar ve damlalar kaybolur.
ESI, özellikle buharlaştırılması ve iyonlaştırılması zor
olan büyük biyolojik moleküller için faydalı bir iyonizasyon tekniğidir.
Atmosferik
Basınç Kimyasal İyonizasyon (APCI): Atmosferik basınç kimyasal iyonizasyon (buna, Heated nebuliser,
APCI da denir) polar bileşikler için kullanılan bir iyonizasyon tekniğidir.
Yüksek performans sıvı kromatografisinden (HPLC) gelen akım
(< 2 mL/dak akış hızı) 600 0C’da buharlaştırılır. Korona deşarj
iğne solvent moleküllerini iyonlaştırır. Solvent ve analit arasındaki
çarpışmalar ve yük transfer reaksiyonlarının etkisiyle ya M+H+ veya M-H-
iyonlarının oluşmasına yol açan proton transferi meydana gelir. Bileşikler
termal parçalanmaya uğrar. Çok değerli iyon oluşumuyla fazla karşılaşılmaz.
Şekil-10: Elektrosprey iyonizayon (ESI)
şematik görünümü
Şekil-11:
Atmosferik basınç kimyasal iyonizasyon (APCI) sistemleri
g.
MALDI: Matrix Assisted Laser Desorption Ionization: MALDI, Hızlı atomik bombardıman (FAB)
iyonizasyona benzer. Örnek, spesifik bir dalga boyundaki kısa pulslu lazerden
gelen ışını absorblayan matriks içinde çözülür, iyonlaşır ve kütle
analizörlerinde ekstrakt edilir. Zaman-yol bağımlı kütle spektroskopiyle (TOF, Time of Flight MS) bileştirilerek
kullanılır, fakat sıvı kromatografisiyle uygun değildir. Yüksek kütle
sayılarına çıkabilme özelliği nedeniyle kullanımı oldukça yaygın bir
iyonizasyon yöntemidir.
MALDI hem pozitif ve ham de negatif iyonlar üretir; bunlar genellikle
(M+H)+, (M+Na)+ ve (M-H)- şeklindedir. Ayrıca, +3’e kadar çok yüklü iyonlarla,
dimerler, trimerler, v.s. de meydana gelir. Ana pik (veya pikler) sadece bir
yük taşır.
Şekil-12:
Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI)
4. Kütle Analizörü
Farklı kütle/yük oranlarındaki iyonların resolusyonu
(ayrılması) için birkaç sistem vardır. En ideali, analizörün çok küçük kütle
farklılıklarını algılayabildiği ve buna bağlı olarak yüksek seviyeli iyon
akımlarının üretilebildiği bir düzenektir. Bu iki özellik, doğrudan doğruya,
birbirinin neden ve sonucu olmadığından aradaki ilişkiyi sağlayan bir sistem
bulundurulur. Bazı uygulamalarda kütle sayıları farkının tam sayı olması
yeterlidir, bazılarında ise farkın daha hassas
olması gerekir; Örneğin, C2H4+, CH2N+,
N2+, ve CO+ iyonlarının saptanması için kütle
farkı 0.01 kütle birimi hassasiyetle bilinmelidir (kütleleri, sırasıyla,
28.031, 28.019, 28.006, ve 27.995 tir). Çeşitli kütle spektrometreleri
arasındaki temel fark, iyonları ayırma sistemidir.
Tablo-3: Farklı
Kütle Analizörlerinin Özellikleri
Metot
|
Ölçülen
özellik
|
Kütle/yük
(m/z) aralığı
|
m/z =
1000’de rezolusyon
|
Dina-mik
aralık
|
Sektör
magnetik
|
moment/yük
|
104
|
105
|
107
|
Uçuş
zamanı (TOF)
|
uçuş
zamanı
|
106
|
103-104
|
104
|
İyon
siklotron rezonans
|
siklotron
frekansı
|
105
|
106
|
104
|
İyon
kapanı
|
frekans
|
104
|
104
|
104
|
Kuadrupol
kütle filtresi
|
m/z için
filtreler
|
103-104
|
103-104
|
105
|
Tipik bazı kütle analizör tipleri:
(a)
Magnetic Sektör Analizörü (MSA): Tek
Odaklamalı: Yüksek rezolusyon, tam kütle, orijinal MA. Çift Odaklamalı: Enerji
seçimini yapan elektrostatik alan ve m/e için magnetik alan
(b)
Zaman-Yol Bağımlı Analizör (TOF): m/z üst
sınır yoktur
(c)
Kuadrupol Analizör (Q): Düşük rezolusyon (1
amu), hızlılık
(d)
İyon Kapanı Kütle Analizörü (QSTAR): İyi
rezolusyon
(e)
FT-Iyon Siklotron Rezonans MS (FT-ICR MS):
Çok yüksek rezolusyon, tam doğru kütle; 1ppm
Tek Odaklamalı MSA (Yüksek
rezolusyon, tam kütle, orijinal MA): Bu tip ayırıcılarda 180,
90 veya 600 lik bir dairesel demet yolu kullanılır; örneğin, Şekil-2'de
900 lik bir yol izlenmektedir. Herhangi bir taneciğin takip ettiği
yol, ona etki eden kuvvetler arasındaki dengeyi belirler. Magnetik merkezcil
kuvvet, FM,
eşitliği ile verilir. Burada H magnetik kuvvet, v taneciğin
hızı, ve e iyon üzerindeki yüktür. Dengeleyen merkezkaç kuvvet (santrifüj
kuvvet), Fc,
m= taneciğin kütlesi,
r =eğrinin yarıçapı, E = taneciğin kinetik enerjisidir. Buradaki V,
iyonizasyon odacığındaki uygulanan hızlandırma potansiyelidir. Formüle göre
kütlelerine bağlı olmaksızın, yükleri aynı olan tüm tanecikler, elektrik
alanında hızlandırıldıklarında, ayni miktarda kinetik enerji kazanırlar. Bu
varsayım sadece yaklaşık olarak doğrudur; çünkü iyonlar hızlandırılmadan önce
de az miktarlarda, fakat farklı enerjiler içerirler. Bir taneciğin kollektöre
giden dairesel yolu geçebilmesi için FM = Fc eşitliğinin
sağlanması gerekir; bu durumda
olur. Denklem(4) ve (3)'de yerine konulup düzenlenerek
aşağıdaki ifade bulunur.
Spektrometrelerin çoğunda, H ve r sabittir; bu nedenle slite
ulaşan taneciğin kütle/yük oranı, hızlandırma voltajı ile ters orantılıdır. Pek
çok tanecikte pozitif tek bir yük bulunur; V nin uygun bir şekilde
ayarlanmasıyla istenilen herhangi bir kütlenin çıkış sliti (yarık) üzerine
odaklanması sağlanabilir.
Çift
Odaklamalı MSA (Enerji seçimini yapan elektrostatik
alan ve m/e için magnetik alan): . Tek odaklamalı cihazların küçük kütle
farklarını (ki bu ayrılma gücüdür) ayırma yeteneği sınırlıdır; çünkü iyon
kaynağını terk ederken taneciklerin sahip oldukları kinetik enerjiler
birbirinden az miktarda farklılıklar gösterirler. Nötral moleküllerin kinetik
enerjilerinin başlangıçtaki dağılımından kaynaklanan bu farklılık, kollektöre
ulaşan iyon demetinin genişlemesine ve ayrılma gücünün kaybolmasına neden olur.
Çift-odaklamalı bir cihazda, demet önce radyal bir
elektrostatik alandan geçer (Şekil-13). Bu alan ayni kinetik enerjili
tanecikleri 2 numaralı slit üzerinde odaklar ve sonra magnetik ayırıcı için
kaynak görevi yapar. Böylece birbirinden bir birim kütlenin küçük kesirleri
kadar farklı olan taneciklerin ayrılması sağlanabilir. Üretilen iyon akımları
çok çok küçüktür ve algılanıp kaydedilmesi için büyük amplifikasyona gereksinim
vardır. Çift-odaklamalı kütle spektrometreler çok pahalı ve bakımı oldukça zor
olan enstrumanlardır.
Şekil-14'de,
Mattauch-Herzog geometrisine göre hazırlanmış diğer bir çift-odaklamalı cihazın
şematik görünümü verilmiştir. Bu geometrik yapı, değişik kütle/yük oranındaki
tüm iyonların tek bir odak düzlemi üzerinde toplanmasına olanak verir; bu
durumda fotoğrafik algılama yapılabilir. Odak düzlemi boyunca kütle/yük oranı
ile doğrusal bir dağılım gözlenir.
Şekil-13: Bir
çift-odaklamalı ayırıcı
Şekil-14:
Çift-odaklamalı kıvılcım-kaynaklı bir kütle spektrometresi
(b) Zaman-Yol Bağımlı
(Uçuş Zamanlı) Analizörler: Bir zaman-yol bağımlı analizördeki ayırmada
magnetik etki bulunmaz. Bunda, kısa süreli bir elektron pulsu ile bombardıman
yapılarak pozitif iyonlar üretilir. Delikli bir levha ile kontrol edilen
pusların frekansı 10000 Hz, yaşam süreci 0.25 s kadardır. Üretilen iyonlar daha
sonra iyonizasyon pulsu ile aynı frekanstaki bir elektrik alanı pulsu ile
hızlandırılır. Hızlandırılmış tanecikler, bir metre boyundaki elektrik alanı
bulunmayan bir "ayırma tüpü" ne girerler (Şekil-15). Daha önce
değinildiği gibi, tüpe giren tüm taneciklerin kinetik enerjisi aynıdır; böylece
her birinin hızı, kütleleri ile ters orantılı olacak şekilde farklı olur
(Denklem-3). Daha hafif tanecikler kollektöre ağırlardan daha kısa zamanda
ulaşırlar.
Zaman-yol bağımlı kütle spektrometrelerdeki dedektör bir
elektron multiplier tüptür; tüpün çıkışı
bir katot ışını osilaskopun dikey döndürme levhalarına beslenir, yatay tarama
hızlandırma pulsları ile senkronize edilerek kütle spektrumun tamamı osilaskop
ekranında hemen görüntülenir.
Şekil-15:
Zaman-yol bağımlı bir kütle spektrometrenin şematik görünümü
Ayırma gücü, tekrarlanabilirlik, ve kütlelerin tanımlanma
kolaylığı bakımından zaman-yol bağımlı analizörler magnetik odaklamalı
analizörler kadar yeterli değildir. Ancak bunların da bazı avantajları vardır;
iyon kaynağına kolaylıkla yerleştirilebilmesi, uçucu olmayan veya
ısıya-dayanıklı örneklerle çalışmayı kolaylaştırır. Ayrıca yaşam süreci kısa
olan örneklerde sonucun hemen alınmasına olanak vermesi bakımından önemledir.
Zaman-yol bağımlı analizörler, çoğunlukla, küçüktür, taşınabilir ve karşıtı
olan magnetik odaklamalı sistemlere göre kullanımı daha kolaydır.
(c) Dört Kutuplu
(Kuadrupol) Analizörler: (Düşük rezolusyon; 1 amu, hızlılık, güçlü bir
kromatografisi dedektörü)
Güçlü bir gaz kromatografisi dedektörüdür. Örnek
kromatografi kolonundan çıktıktan sonra, kütle spektrometrenin girişinde
bulunan bir transfer hattından geçer ve bir elektron-şok iyon kaynağıyla
(electron-iyonizasyon, EI) veya kimyasal iyonizasyonla (CI) iyonlaştırılır,
fragmanlara (parçacıklar) ayrılır.
"Dört Kutuplu" spektrometrede, demetin etrafında
dört tane kısa, paralel metal çubuk bulunur (Şekil-16). Çubukların bir çifti
bir doğru akım kaynağının pozitif ucuna bağlanır. Ayrıca her iki çifte bir
radyo-frekanslı alternatif akım potansiyeli uygulanır. Alanlardan ikisi de iyon
kaynağından çıkan pozitif tanecikleri hızlandıracak bir etki yapmaz, fakat
birleştirilen alan, taneciklerin kendi hareketlerinin merkez eksenini etrafında
titreşmesine neden olur; böylece çubuklardan biri ile çarpışarak saptırılmadan,
sadece bazı kütle/yük oranındaki tanecikler geçebilirler. Uygulanan alternatif
akımın veya iki kaynağın potansiyellerin değiştirilmesi, fakat oranın sabit
tutulması ile kutuplu spektrumu çizilir.
Şekil-16: (a) Dört-kutuplu bir kütle spektrometresi, (b) üç
kademeli kuadrupol (TSQ) bir kütle analizörü,
(c) bir MS/kuadropol MS sistemin şematik görünümü
(d). İyon Kapanı
Kütle Analizörü (QSTAR): İyon kapanı analizörü, kuadrupol kütle
spektrometrenin modifiye edilmiş br şeklidir. Kombine bir GC/MS enstruman
sisteminden daha çok, bir gaz kromatografisi dedektörü olarak dizayn
edilmiştir. (Şekil-17). İyon kapanı analizöründe üç elektrot bulunur. Merkez
elektrot halka; üst ve taban elektrotlar yarım küre şeklindedir. İyonizasyon ve
kütle analizi aynı yerde gerçekleşir. Ayrılan iyonlar bir iyon dedektörüyle
ölçülür; kullanımı en yaygın olan dedektör, sürekli dinod tip bir iyon
dedektörü olan elektron multiplierlerdir.
Şekil-17: MS/iyon kapanı (IT) sistemin
şematik görünümü
e.
FT-İyon Siklotron Rezonans MS (FT-ICR MS) Fourier-Transform Mass Spectrometry: (Çok yüksek rezolusyon, tam doğru
kütle; 1ppm).
FT-ICR kütle spektrometresinde sabit bir magnetik alanda
iyonların siklotron frekansından yararlanılarak geliştirilmiş bir
spektrometredir. (Şekil-18)
İyonlar özel bir kapanda tutulur (yüklü tanecikleri
depolamak için sabit magnetik alan ve sabit elektrik alanının uygulandığı bir
kapan) ve burada magnetik alana dik bir osile bir elektrik alanı tarafından
daha büyük bir siklotron çapına uyarılır; Alınan sinyal, zamanın fonksiyonu
olarak görüntü akımı (zaman-bağımlı) olarak kaydedilir. Fourier transform ile zaman-bağımlı
sinyal frekans-bağımlı spektruma, yani kütle spektrumuna dönüştürülür.
Şekil-18: Bir ICR kapan
Spektrumdaki pik genişlikleri çok dardır; dolayısıyla benzer
m/z değerindeki iki farklı iyonu algılayabilecek hassasiyete sahiptir. Örneğin,
800.000 Da kütledeki bir pik, 800.001 Da kütledeki bir pikten ayırt edilebilir.
FTICR kütle spektrometresi, yeni bölünme (veya parçalanma )
tekniklerinin kullanılmasına olanak verir; örneğin, infrared lazer aktivasyon,
elektron-yakalama disosiyasyon gibi. Bu teknikler tüm proteinlerde olduğu gibi,
çok büyük molekül parçalarını incelemede kullanılmaktadır.
FT-ICR MS uygulamalarına bazı örnekler verilebilir:
Makromoleküller, kalıntı analizleri, meabolomikler, proteinler, peptidler,
kompleks karışımlar (örneğin, ham petrol gibi), izotoplar, v.s.
5. İyon Akımlarının
Görüntülenmesi ve Ölçülmesi
Ayırıcıdan gelen iyonlar bir slitten geçerek, sapmış
iyonlara karşı korunan bir elektrot üzerinde toplanır. Cihazların çoğunda,
üretilen akım büyük bir dirençten toprağa verilirken oluşan potansiyel düşmesi
bir elektrometre tüpünün kafesinde veya bir alan etkili transistörde algılanır.
Oluşan akım yükseltilerek kaydediciye gönderilir. Başka bir yöntemde,
ayırıcıdan gelen iyonlar bir katot yüzeyine çarparak elektron çıkarırlar.
Oluşan elektronlar bir diyota doğru hızlandırılırlar ve diyota çarparak yeni
elektronlar üretirler. Bu işlem bir kaç kez tekrarlanarak, bir fotomultiplier
tüpte olduğu gibi, çok fazla yükseltilmiş bir elektron akımı elde edilir. Bu
akım elektronik olarak bir yükseltme aşamasından daha geçirildikten sonra kaydedilir.
İyon akımları normal olarak küçüktür ve 10-17 –10-9
A0 aralığında değişir. 10-17 A0 'lik bir akım,
dedektöre saniyede 60 kadar iyonun ulaşması demektir. Değişik miktarlardaki
iyonların oluşturduğu pikleri kaydetmek için kütle spektrometrelerin çoğunda,
farklı akım aralıklarını kaydeden, birkaç kalem bulunur. Böylece, akımın
büyüklüğüne bağlı olmaksızın, kaydedici kağıtta uygun büyüklükteki her pik görülebilir.
Bazı cihazlarda, hassas kağıt üzerine kayıt yapan bir aynalı galvanometreler
sistemi vardır; her bir galvanometrenin farklı algılama aralığında olması geniş
bir aralıktaki piklerin tümünün kaydedilmesine olanak verir. Şekil-8'de tipik
bir tarama spektrumu görülmektedir.
6. Bilgisayarlı Kütle
Spektrometreleri
Modern kütle spektrometrelerde minikompüterler ve
mikroprosesörler cihazı tamamlayıcı sistemlerdir. Bir kütle spektrumunun en
önemli özelliği verdiği yapısal verilerin çokluğudur. Örneğin, molekül ağırlığı
400-500 arasında olan bir molekül, bir elektron demeti ile 200 kadar değişik
iyona bölünür, bunların herbiri de farklı spektral pik verir. Yapısal bir tayin
için her bir pikin yüksekliğinin ve kütle sayısının saptanması, toplanması, ve
görüntülenmesi gerekir. Verilerin sayısının çok fazla olması, bunların hızla
toplanmasını ve süratle işlemlendirilmesini gerektirir; bu ise en ideal şekilde
bilgisayarlarla yapılabilir. Kütle spektral verilerinin faydalı olabilmesi için
veriler toplanırken birkaç enstrumantal değişkenin de çok sıkı bir şekilde
kontrol edilmesi gerekir. Bu tip kontroller en iyi bilgisayarlar veya
mikroprosesörlerle yapılabilir.
Bir kütle spektrometresi ve bir bilgisayar arasındaki ara
yüz, yükseltilmiş iyon-akımı sinyali ve enstrumantal değişkenlerin kontrolünde
kullanılan diğer sinyalleri sayısal hale dönüştürür. Enstrumantal değişkenleri
kontrol eden sinyallerin kaynakları, kaynak sıcaklığı, hızlandırma voltajı,
tarama hızı ve magnetik alan kuvveti gibi parametrelerdir.
Sayısal hale dönüştürülen iyon-akımı sinyali görüntülenmeden
önce bazı işlemlerden geçirilir. Önce, pikler normalize edilmelidir; bunun için
her bir pikin yüksekliği, referans bir pike karşı hesaplanır. Bu işlemde
çoğunlukla, en yüksek pik referans olarak alınır ve bunun yüksekliği 100 (veya
1000) kabul edilir. Her pikin bir kütle numarası da olmalıdır. Numaralama pikin
çıkış zamanı ve tarama hızına göre yapılır. İşlemde periyodik kalibrasyona
gereksinim vardır. Kalibrasyonda standart olarak fluorlu bir hidrokarbon
kullanılır.
Yüksek rezolusyonlu çalışmalarda örnek ve standard beraberce
analize alınır. Sonra bilgisayar, kütle ölçümlerinde standardın pikini referans
olarak algılayabilecek şekilde programlanır. Düşük-rezolusyonlu çalışmalarda,
benzer pikler üst üste düşeceğinden, kalibrasyon ayrı olarak taranır.
Zaman dışındaki değişkenler kütle numarasını belirlemede
kullanılır. Dört kutuplu spektrometrelerde yapılan analizlerde dedektöre ulaşan
iyonun kütlesi çubuklar arasına uygulanan alternatif akım voltajı ile doğru
orantılıdır. Bu nedenle, bir çubuk voltaj sinyali sayısal hale dönüştürülerek
iyon-akımı sinyali üzerine bindirilir. Bilgisayar da, kütle numarasını sonuçta
elde edilen sinyalden hesaplayacak şekilde programlanır. Magnetik
enstrumanlarda bir Hall probu bulunur, kütle verileri bu prob ile ölçülen
magnetik alan kuvvetine göre çıkarılır.
Bilgisayar çıkışı sayısal veya grafiksel görüntüde olabilir.
Şekil-21’de her iki görüntüye de birer örnek verilmiştir. Sayısal görüntüdeki
tek sayılı kolonlarda kütle sayıları artan bir sıraya göre dizilmişlerdir. Çift
sayılı kolonlardaki değerler, iyon akımlarının en büyük pike göre normalize
edilmiş değerleridir; en büyük pik 156 kütle numaralı tanecik için saptanmış ve
bu taneciğin akımı 1000 numara ile gösterilerek diğer pik yükseklikleri buna
göre hesaplanmıştır. Örneğin, 141 kütledeki pik, ana pikin %82.6 sı kadardır.
7. Kütle
Spektrometrelerin Resolusyonu (Ayırma Gücü)
Bir kütle spektrometresinin kütleleri ayırabilme yeteneği,
m/Dm ile gösterilen rezolusyonu ile
ifade edilir. Buradaki m ve m + Dm,
eşit büyüklükte ve birbirinden tam olarak ayrılabilen iki taneciğin kütlelerini
gösterir.
Kütle analizörlerinde rezolusyon, %10 ve %50 çukurluk
(valley) ile tanımlanır:
·
%50 çukurluk: iki pik arasındaki minimum
(çukurluk), pik yüksekliğinin %50’sinden daha fazla değilse, pikler birbirinden
ayrılabilir.
·
%10 çukurluk: iki pik arasındaki minimum
(çukurluk), pik yüksekliğinin %10’undan fazla olmamalıdır.
Şekil-19: Rezolusyon tanımları: (a) %10 ve
%50 çukurluk, (b) FWHM
TOF (time of flight) kütle spektrometre için Dm, pik yüksekliğinin, yarısındaki pik
genişliği (full width at half maximum, FWHM) olarak tanımlanır:
Dm
= FWHM
Bu tanıma göre rezolusyon aşağıdaki formülle ifada edilir.
RS = 15 000 (FWHM)
Bir kütle spektrometrede istenilen rezolusyon onun kullanım
amacına bağlıdır. Örneğin nominal kütleleri birbirine eşit olan N2+
(28.006) ve CO+ (27.995) gibi iki taneciğin birbirinden
ayrılabilmesi için rezolusyonu birkaç bin olan bir cihaza gereksinim vardır.
Oysa, birbirinden 1 veya daha fazla kütle birimi kadar farklı düşük-molekül
ağırlıklı taneciklerin ayrılması için 50 den daha düşük bir rezolusyon
yeterlidir; NH3+ ve CH4+ nın
ayrılmasında olduğu gibi.
Örneğin büyük parçalara bölünmesi durumunda birim kütle
farklılığındaki ayırmalar 250-500 rezolusyonlu bir spektrometre ile
çalışılabilir.
Tablo-4'de, çeşitli ticari kütle spektrometreleri için tipik
rezolusyonlar ve kütle aralıkları verilmiştir. Cihazların fiyatları bu iki
değere göre değişir.
Tablo-4: Bazı Tipik
Ticari Kütle Spektrometrelerin Kıyaslaması
Tipi
|
*Kütle aralığı
|
*Rezolusyon
|
Tipi
|
*Kütle aralığı
|
*Rezolusyon
|
Çift
odaklamalı
|
2-5000
|
10000-
20000
|
uçuş
zamanlı
|
1-700
|
150
|
1-240
|
1000-250
|
0.250
|
130
|
||
Tek
odaklamalı
|
1-1400
|
1500
|
dört
kutuplu
|
2-100
|
100
|
2-700
|
500
|
2-80
|
20-50
|
||
2-150
|
100
|
