Fluoresans cihazlarının kısımları ultraviyole-görünür
fotometreler veya spektrofotometrelerdekine benzer. Şekil-2'de bu kısımların
bir "fluorometre" veya "spektrofluorometre" deki
dizilişleri gösterilmiştir. Hemen hemen tüm fluoresans cihazlarda, kaynak
gücündeki dalgalanmaları gidermek için, çift demetli optikler kullanılır. Önce
örnek demeti bir uyarıcı filtre veya monokromatörden geçerek örnekten çıkan
fluoresans dalga boylarını uyarır, fakat diğer dalga boylarını etkilemez. Örnekten
her yönde fluoresans ışın emitlenir, bunlar en iyi, uyarılan demete göre doğru
açı altında gözlenebilir; çözeltiden ve hücre duvarlarından saçılan diğer
ışınlar fluoresans şiddetin ölçülmesinde hatalara neden olabilirler. Emitlenen
ışın, ölçülecek fluoresans piki ayıran ikinci bir filtre veya monokromatörden
geçtikten sonra bir fotoelektrik dedektöre ulaşır.
Referans demet, gücünü fluoresans ışına göre 100 kat veya
dahafazla azaltan bir atenuatörden geçer; referans ve örnek fototüplerinin
çıkışı sonra bir işlem amplifikatörüne, bunun çıkışı da bir metre veya
kaydediciye beslenir. Fluoresans cihazların çoğu null tiptir, bu durum optik
veya elektrik amplifikatörlerle sağlanır.
Şekil-2: Bir fluorometre veya
spektrofluorometrenin kısımları
Fluorometre ve spektrofluorometrelerin karmaşıklığı ve
performans özellikleri absorbsiyon cihazlarından oldukça değişiktir.
Fluorometrelerdeki uyarılan ve emitlenen dalga boylarını sınırlayan filtreler
absorbsiyon fotometrelerdekine benzer. Spektrofluorometreler iki tiptir.
Birincisinde, uygun bir filtre ile uyarılan ışın sınırlandırılır ve bir grating
veya prizmalı monokromatörle bir fluoresans emisyon spektrumu piki ayrılır.
Bazı ticari spektrofotometrelerde bunların spektrofluorometre olarak
kullanılmasına olanak veren adaptörler bulunur.
1.
Cihazların Kısımları
Fluorometreler ve spektrofluorometreler sadece detaylarda
farklıdır; burada bu farklılıklar belirtilecektir.
Kaynaklar: Uygulamaların
çoğunda, absorbsiyon ölçmelerinde kullanılan tungsten veya hidrojen lambasından
daha şiddetli bir kaynağa gereksinim vardır. Bu bir civa veya ksenon ark
lambası olabilir.
Ksenon ark lambası, akımın bir ksenon atmosferinden
geçirilmesiyle yüksek şiddette ışın üretir. Spektrum 250-600 nm dolayında bir
pik verir. Bazı cihazlarda, lambada bir kapasitörün deşarjı ile düzgün
pırıltılar elde edilir; böylece yüksek şiddetler alınır. Ayrıca, fototüplerin
çıkışı ac olduğundan tümüyle kuvvetlendirilerek iletilebilir.
Civa ark lambaları şiddetli hat spektrumu verirler.
Yüksek-basınç lambaları (~ 8 atm.) 366, 405, 436, 546, 577, 691 ve 773 nm'de
hatlar verir. Düşük basınç lambalarında silika pencereler bulunur, bunlar
ayrıca 254 nm'de’de şiddetli bir hat verirler. Fluoresans bileşiklerin
çoğundaki fluoresans davranış dalga boylarındaki bir değişiklikten
etkilendiğinden, civa hatlarından en az bir tanesinin bulunması yeterlidir.
Son gelişmelerde fluorometrede çeşitli lazer kaynakları
kullanılmaya başlanmıştır. Pulslu bir azot lazerinin bulunduğu ayarlanabilir
boya lazeri bunlardan biridir. Bu kaynakla 360-650 nm arasında ışın üretilir.
Böyle bir sistemle çalışıldığında bir uyarma monokromatörüne gereksinim olmaz.
Filtreler ve
Monokromatörler: Fluorometrelerde girişim ve absorbsiyon filtreleri
kullanılır. Spektrofluorometrelerin çoğunda ise gratingli monokromatörler
bulunur.
Dedektörler: Tipik
fluoresans sinyalin şiddeti düşüktür ve ölçülmesi için büyük derecelerde
kuvvetlendirmeye gereksinim vardır. Hassas fluoresans cihazlarda dedektör
olarak en çok fotomultiplier tüpler kullanılır.
Hücreler ve Hücre
Bölmeleri: Silindirik ve dikdörtgen hücreler cam veya silikodan yapılır.
Hücrenin bulunduğu bölme dedektöre ulaşan saçılan ışını en aza indirecek
şekilde dizayn edilmelidir. Bu amaçla bölmeye baffıllar yerleştirilir.
Şekil-3: Turner model 110
fluorometrenin, optik dizaynı
Fluorometreler: Şekil-3'de,
bir civa lambası ve tek bir fotomultiplier tüp (dedektör olarak) bulunan
çift-demetli bir fluorometrenin şematik diyagramı verilmiştir.
Lambadan gelen ışının bir kısmı bir filtreden geçerek örneğe
gelir. Fluoresans ışın sonra ikinci bir filtreden dedektöre geçer bir referans
demet ışık kamının aynalanmış yüzeyinden, fotomultiplier tüpü yönlendiren bir
parlak ışık borusuna yansıtılır. Dönen ışık kesici bu referans demetin ve
fluoresans demetin, sıra ile, dedektör yüzeyine çarpmasını sağlar, böylece
güçleri farklı olan demetler bir ac sinyali üretirler; ac sinyalinin fazını
kuvvetli olan demet belirler. Bu fark ve işareti, bir faz-hassas aletle bir
metre ibresini hareket ettirecek şekle dönüştürülür (Şekil-3'de
gösterilmemiştir). Referans demetin gücü sonra ışık kamının dönmesiyle değişir,
kam dedektöre ulaşan referans demetin miktarını mekanik olarak artırır veya azaltır.
Kamda, herbir bölmesi eşit miktarda ışığı belirten doğrusal bir kadran bulunur.
Bir null aleti her iki yönden de sıfırlanabilecek şekilde
ayarlanmalıdır. Tümü fluoresans olmayan bir örnek için dedektöre fazlardan
birinden ışık gelmeyeceğinden null noktasına sadece bir yönden ulaşılır.
Sonucun hatalı olmaması için, dedektöre fluoresans demetle "faz
içinde" olan sabit şiddetli üçüncü bir demet (ışık yolu yönünde)
gönderilir, böylece fotomultipliere bir miktar ışın çarpar. Ölçülen fluoresansa
üçüncü demetin etkisi, hücre bölmesine bir şahit konulup fluoresans kadranı
sıfıra ayarlanarak giderilir; referans demetin şiddeti, optik bir null
noktasına ulaşılıncaya kadar şahit tarafından azaltılır. Bu işlem bir seri
analiz sırasında sık sık yapılmalıdır.
Bu tip çift-demetli cihazda tek-dedektörle, kararlı dedektör
hassasiyeti ve kaynak çıkışı için uzun-zaman gerektiği halde,
tekrarlanabilirlik çok iyidir. Bu nedenle kalibrasyon eğrilerinin, sadece arada
sırada, bir standartla kontrolü yeterli olur. Bazı cihazlar tek-ışın yollu
olarak dizayn edilmişlerdir.
Spektrofluorometreler:
Spektrofluorometre yapan birkaç firma bulunur. Basit ve tipik bir cihaz
Şekil-4'de gösterilmiştir. Bunda iki tane gratingli monokromatör vardır. Ksenon
lambasından gelen ışın birinci monokromatörde dağıtılır ve örneği uyarır.
Oluşan fluoresans ışın, ikinci monokromatörden dağıtıldıktan sonra, bir
fotoselde algılanır. Okuma bir metre veya kaydedici ile yapılır. Cihaz, sadece
birinci monokromatör ile, absorbans ölçmelerinde kullanılabilir.
Şekil-4'deki gibi bir cihaz ile kantitatif analizlerde
fevkalade spektrumlar alınır. Spektranın mükemmelliği çıkışın sadece
fluoresansa değil, aynı zamanda lambanın özelliğine, dedektöre ve
monokromatörlere de bağlı olmasından kaynaklanır.
Bütün bu cihaz özellikleri dalga boyu ile değişir ve
cihazdan cihaza farklı bir durum gösterir. "Düzeltilmiş" (cihazın
etkilerinden kurtarılmış) bir spektrum elde edebilmek için çeşitli yöntemler
geliştirilmiştir; yeni ve geliştirilmiş cihazlar doğrudan doğruya düzetilmiş
spektrayı çizerler.
Şekil-4: Bir spektrofluorometre (cihaz absorbsiyon ölçmelerinde de kullanılabilir)
2. Fluorometrenin Uygulama Alanları
Fluorometrik yöntemler, spektrofotometrik tayinlerdekinden
daha düşük konsantrasyonlara uygulanabilir. İki yöntem arasındaki temel
farklılık, fluorometrede konsantrasyon-ilişki parametresinin (F) kaynağın
gücünden (P0) bağımsız olarak ölçülebilmesidir. Tersine,
spektrofotometrik ölçmelerde P0 ve P etkindir, çünkü konsantrasyona-bağımlı
A parametresi bu iki miktarın oranına bağlıdır. Bir fluorometrik yöntemin
hassasiyeti P0 ın artırılması veya fluoresans sinyalin daha fazla kuvvetlendirilmesiyle
artırılabilir. Spektrofotometrede ise P0'ın artırılması P'nin’de
orantılı olarak artmasına neden olacağından A'yı etkilemez; böylece,
hassasiyette bir yükselme elde edilemez. Benzer şekilde, dedektör sinyalinin
kuvvetlendirilmesi de P ve P0 üzerinde ayni derecede etki
yapacağından A'da herhangi bir iyileşme sağlanamaz. Bu nedenlerle, fluorometrik
yöntemler, ayni amaçlarla kullanılan spektrofotometrik işlemlerden 1-4 derece
kadar daha hassas sonuçlar verir.
3.
İnorganik Analizler
İnorganik fluorometrik yöntemler iki tiptir. Birincisi
doğrudan analiz yöntemidir; bunda, bir fluoresans şelat oluşturularak bunun
emisyonu ölçülür. İkinci yöntemde, analizi yapılan maddenin söndürülme
(guenching) özelliğinden yararlanılır; yöntem fluoresanstaki azalmanın
ölçülmesine dayanır (anyon analizlerinde çok kullanılır).
Fluoresans Şelat
Oluşturan Katyonlar: Fluoresans şelat oluşturan geçiş-metallerinin sayısı
iki nedenle sınırlanır. Birincisi bu iyonların çoğunun paramagnetik olmasıdır;
bu özellik sistem içi geçiş hızını artırarak üçüz hale geçişi kolaylaştırır. Bu
durumda fosforesans davranış gözlenebildiği halde, fluoresansla deaktivasyon
oluşamaz. İkinci neden, geçiş-metalleri komplekslerinde çok yakın ve çok sayıda
enerji seviyelerinin bulunmasıdır; bu durum deaktivasyonun iç geçişle
gerçekleşme olasılığını yükseltir. Geçişsiz-metal iyonlarında üçüz halden veya
iç geçiş sonucu deaktivasyon işlemlerine çok nadiren raslanır; bu tip iyonlarda
fluorometre uygulanabilir. Geçişsiz-metal katyonların çoğunlukla renksiz
olduklarını ve renksiz şelatlar yapma eğilimlerini de belirtmek gerekir; bu
nedenle, çoğu zaman, spektrofotometreyi tamamlayıcı bir yöntemdir.
Fluorometrik
Reaktifler (Maddeler): Katyon analizlerinde kullanılan en başarılı
fluorometrik reaktifler, metal iyonu ile şelat yapmayı sağlayacak iki veya daha
fazla fonksiyonel grubu bulunan aromatik yapılardır. Bu tip dört maddenin
yapıları aşağıda verilmiştir:
Seçilmiş bazı fluorometrik reagentlar ve uygulamaları ise
Tablo-2'de verilmiştir. Daha fazla bilgi için çeşitli literatürlerden
yararlanılabilir.
Tablo-2: İnorganik Maddeler İçin Seçilmiş Fluorometrik Yöntemler
İyon
|
Reagent
|
Dalga Boyu, nm
|
Hassasiyet, mg/ml
|
Engelleyici
(girişim)
|
|
Absorb-siyon
|
Fluore-sans
|
||||
Al+3
|
Alizarin garnet R
|
470
|
500
|
0.007
|
Be,
Co, Cr, Cu, F-, NO3-, Ni, PO4-3,
Th, Zr
|
F-
|
Alizarin garnet R-Al kompleksi
|
470
|
500
|
0.001
|
Be,
Co, Cr, Cu, Fe, Ni, PO4-3, Th, Zr
|
B4O7-2
|
Benzoin
|
370
|
450
|
0.04
|
Be,
Sb
|
Cd+2
|
2-(o-hidroksifenil)
benzoksazol
|
365
|
Mavi
|
2
|
NH3
|
Li+
|
8-hidroksi-kinolin
|
370
|
580
|
0.2
|
Mg
|
Sn+4
|
Flavanol
|
400
|
470
|
0.1
|
F-,
PO4-3, Zr
|
Zn+2
|
Benzoin
|
-
|
yeşil
|
10
|
B,
Be, Sn, renkli iyonlar
|
Organik sorunlara uygulanan fluorometrik analizlerin sayısı
şaşırtıcıdır. "Organik ve Genel Biyokimyasal Maddeler" başlığı
altında 100'den fazla madde için bilgi bulunabilir.
Adenin, antranilik asit, aromatik polisiklik hidrokarbonlar,
sistein, guanidin, indol naftoller, bazı sinir gazları, proteinler, salisilik
asit, skatol, triptofan, ürik asit, ve varfarin bu tablolardaki bazı
maddelerdir. Fluorometrik olarak analiz edilebilen 50 kadar tıbbi madde
sayılabilir. Bunlardan bazıları adrenalin, alkilmorfin, kloroquin, digitalis
prinsipıls, liserjik asit dietilamin (LSD), penisilin ve fenobarbütaldir.
Bu tablolarda on kadar steroid ve bir o kadar da enzim ve
koenzim için de analiz yöntemleri bulunur. Bazı sanayi ürünlerinin analiz
yöntemleri de verilmiştir; klorofil, ergot alkoloidler, rauwolfia alkaloidleri,
lavanoidler, ve reten analizleri gibi. Vitaminler ve vitamin ürünlerini içeren
18 kadar tablo bulunur; askorbik asit, folik asit, nikotinamid, pridoksal,
ribovlavin, tiamin, vitamin A, ve Vitamin B12 bu tablolarda bulunan maddelerden
bazılarıdır.
Fluorometrenin yiyeceklerde, farmasetiklerde, klinik
örneklerde, ve doğal ürünlerde çok geniş bir uygulama alanı bulunur. Yöntemin
bu alanda başarıyla uygulanabilmesinin en önemli nedeni hassasiyeti ve
seçiciliğidir.
