FOTOMETRİK TİTRASYONLAR
Fotometrik ve spektrofotometrik ölçmeler bir titrasyonun son
noktasını saptamakta kullanılabilir. Doğrudan yapılan bir fotometrik
titrasyonda son nokta, reaksiyona giren maddenin(titrant) veya reaksiyondan
elde edilen maddenin (ürün) veya her ikisinin birden konsantrasyonundaki
değişikliğin sonucudur; bu maddelerden en az birinin belirli bir dalga boyunda
ışın absorblaması gerekir. Doğrudan titrasyonda titrant hacmine göre
indikatörün absorbansı izlenir.
Titrasyon Eğrileri
Fotometrik bir titrasyon eğrisi,
düzeltilmiş absorbans değerlerinin titrant hacmine göre çizildiği bir
grafiktir. Özel koşullarda, elde edilen grafikte eğimleri birbirinden farklı
iki düz-hat bulunur, biri tirasyonun başlangıcında, diğeri ise eşdeğerlik noktasından
sonraki kısmında bulunur; son nokta, iki doğrunun ektrapolasyonu ile elde
edilen kesişme noktasıdır. Şekil-1a, ışın absorblamayan bir maddenin renkli bir
titrant ile titrasyonunu gösterir. Madde ile titrantın reaksiyonu renksiz bir
ürün verir ve titrasyon eğrisinin birinci bölümü yatay bir doğru şeklindedir.
Eşdeğerlik noktasından sonra absorbans hızla artar (titrantın rengi nedeniyle
geçirgenlik azalır). Şekil-1b ise örnek ve titrantın renksiz, reaksiyonda
oluşan ürünün renkli olduğu bir titrasyon eğrisidir. Titrasyonun başlangıcından
itibaren renkli ürün oluşumu nedeniyle absorbans artar, eşdeğerlik noktasından
sonra absorbans titrant miktarından etkilenmez ve eğrinin ikinci yarısı yatay
bir doğru şeklini alır. Örnek, titrant ve ürünün özelliklerine bağlı olarak
Şekil-1'deki diğer eğriler (c, e, f) elde edilebilir.
İyi bir fotometrik eşdeğerlik
noktası elde edebilmek için absorblayıcı sistemin (veya sistemlerin) Beer
kanununa uyması gerekir; aksi halde, titrasyon eğrisindeki iki doğrusal bölge
düzgünlüğünü kaybeder ve son nokta için gerekli olan ekstrapolasyon yapılamaz.
Diğer bir konu, absorbans
değerlerinin hacim değişikliğine göre düzeltilmesidir. Bunun için gözlenen
absorbans değerleri ile, V = örneğin titrasyondan önceki hacmini, v = ilave
edilen titrant hacmini gösterdiğine göre, Adüzeltilmiş hesaplanır.
Şekil-1: Tipik fotometrik titrasyon eğrileri; titre edilen
örneğin, ürünün ve titrantın molar absorbtiviteleri sırasıyla, es, ep, et ile gösterilmiştir
Cihaz
Fotometrik titrasyonlar, ışık yolu
üzerine bir titrasyon kabı yerleştirilebilecek şekilde dizayn edilmiş herhangi
bir fotometre veya spektrofotometrede yapılabilir. Cihazda sıfır ayarı
yapıldıktan sonra ışının analit çözeltiden geçmesi sağlanır, uygun bir
absorbans değeri okunacak şekilde kaynak şiddeti veya dedektör hassasiyeti
değiştirilir. Fotometrik titrasyonda başlangıçta örneğin gerçek absorbansını
ölçmeye gerek yoktur, çünkü relatif değerlerle son-nokta tayininde daha
başarılı olunur. Cihazın ayarları değiştirilmeden titrasyon yapılır ve veriler
toplanır.
Bir fotometrik titrasyonun
yapıldığı süre boyunca ışın kaynağının gücü ve dedektör algılaması sabit
kalmalıdır. Titrasyonda silindir şeklinde bir kap kullanılır. Deney sırasında
kabın yeri değişmemelidir; çünkü, kabın yeri ışın yolunun uzunluğunu saptar. Filtreli
fotometreler ve spektrofotomereler bu amaçla kullanılabilmektedir. Özellikle
spektrofotometreler daha dar bandlar verdiğinden fotometrelere tercih
edilirler.
Fotometrik
Titrasyonun Uygulaması
Fotometrik titrasyonlar çoğu zaman
doğrudan fotometrik analizlere göre daha doğru sonuçlar verir; çünkü son nokta
bir kaç değerden elde edilir. Ayrıca örnekte diğer absorblayıcı maddelerin
bulunması, titrasyonda sadece absorbans değişikliği ölçüldüğünden, tayini
engellemez.
Fotometrik eşdeğerlik noktası
yöntemi, verilerin eşdeğerlik-noktası bölgesinde alındığı diğer son nokta tayin
metotlarından çok daha avantajlıdır. Fotometrik titrasyon reaksiyonlarında,
örneğin potansiyometrik (veya indikatör) dönüm noktası titrasyonlarında olduğu
gibi, denge sabitlerine gereksinim yoktur. Bu nedenle, çok seyreltik
çözeltilerin bile analizi yapılabilir.
Fotometrik son nokta her tip
reaksiyona uygulanabilir. Yükseltgenme-indirgenme titrasyonlarında kullanılan
titrant maddelerinin çoğunun karekteristik absorbsiyon spektrumları vardır, bu
nedenle fotometrik olarak saptanabilen son noktalar verirler. Fotometrik
nötralizasyon titrasyonlarında asit-baz indikatörler kullanılır. Fotometrik son
nokta, EDTA ve diğer kompleks yapıcı maddelerin titrasyonunda da çok
avantajlıdır. Şekil-2'de bizmut(3) ve bakır(2) karışımının fotometrik titrasyon
eğrisi verilmiştir. 745 nm’de katyonların da titrantın da absorbsiyonu yoktur.
Titrasyonun birinci bölümünde titrant (0.1N EDTA çözeltisi) ile çok kararlı
bizmut kompleksi oluşur; bu kompleks de 765 nm’de absorbsiyon yapmaz. Bu
nedenle bizmut(3) iyonlarının tamamı kompleks haline dönüşünceye kadar sistemde
herhangi bir absorbsiyon gözlenmez. Bakır(2) iyonlarının EDTA ile titrasyonu
başladığında reaksiyon sonucu oluşan bakır kompleksi nedeniyle absorbans değeri
artmaya başlar (Cu EDTA kompleksi 765 nm'deki ışını absorblar). Absorbans,
çözeltideki bakır iyonları bitinceye kadar yani eşdeğerlik noktasına
ulaşılıncaya kadar artar, sonraki titrant ilaveleri absorbans değerini
değiştirmez. Deneyde iki güzel son nokta elde edlir.
Fotometrik son nokta çökelme
titrasyonlarına da uygulanabilir; burada, ortamda asılı katı tanecikler olarak
bulunan ürün gelen-ışının saçılmasına neden olarak gücünü azaltır; titrasyona
bulanıklığın sabit olmasına kadar devam edilir.
Şekil-2: 2 x 10-3 N Bi+3 ve Cu+2
içeren 100 ml çözeltinin fotometrik titrasyon eğrisi; dalga boyu 745 nm
OTOMATİK FOTOMETRİK
VE SPEKTROFOTOMETRİK ANALİZLER
Son yirmi yılda cihazlarda yapılan
en önemli gelişme analiz sistemlerinin son derece otomatik duruma getirilmiş
olmasıdır. Bu tip cihazlara en fazla gereksinim duyulan yerler, çok sayıda
örneğin kısa sürede analizinin yapılması gereken klinik laboratuvarlarıdır. Bu
tip cihazlar artık endüstriyel ürünlerin ve su, hava, ve zirai maddelerin rutin
analizlerinde de kullanılmaktadır.
Klinik analizlerin çoğu
ultraviyole veya görünür bölgede fotometrik veya spektrofotometrik ölçmelere
dayanır. Otomatik sistemlerde atomik spektroskopi de kullanılabilir ve analit
konsantrasyonunu ölçmek için elektroanalitik yöntemler uygulanır. Aşağıda iki
otomatik sistem ve kısa açıklamalar verilmiştir.
Sürekli - Akış
Analizörü
Sürekli bir analizörde tüp ve
odacıklardan oluşan bir sistemden çeşitli örnekler birbiri arkasında sıra ile
geçer. Bu durumda birbirini kirletmemeleri için örneklerin ayrılması ve her
örnek geçişinden sonra sistemin temizlenmesi gerekir. Tehnicon Auto Analizörde
(ilk ticari cihaz) örnek, titrant, ve seyrelticinin plastik tüpteki ilerleyişi
peristaltik bir pompa ile yapılır. Peş peşe gelen örneklerin birbirinden ayrılması
için de tüp içine hava kabarcıkları gönderilir.
Şekil-3'de kandaki maddelerden
birinin analizinde kullanılan tek-kanallı bir otoanalizörün şematik diagramı
verilmiştir. Örnekler otomatik olarak ve sıra ile alınır, seyreltici ve hava
kabarcığı ile karıştırılır. Hava kabarcığı karışmayı kolaylaştırır ve her bir
örneğin bir diğerinden ayrılmasına yardım eder. Seyreltilen örnek dializöre
girer. Burada, küçük analit iyonlarının veya moleküllerinin titrant akımına
geçebilmesini sağlayan membranlar vardır. Membranlardan geçemeyen kandaki
büyük-protein molekülleri dializörden dışarı atılır.
Rutin kan analizi için kullanılan
bir sistemde örneği seyrelten ve bir kaç kısma ayıran bir düzenek bulunur.
Ayrılan her bir parça seyreltilmiş örnek, Şekil-3'dekine benzer (ayrı)
kanallardan geçer. Böyle tipik bir sistemin çıkış verileri Şekil-4'de görüldüğü
gibidir.
Şekil-3: Tek kanallı Technicon Autoanalizör sistemi
Şekil-4: Çok kanallı Technicon Autoanalizör’ün çıkışı
Santifüjlü Hızlı
Analizör
Bu tip analizörlerde örnekteki
maddelerden birinin analizi yapılır. Sisteme aynı anda 16 örnek konulabilir.
Örnek ve kimyasal madde bir santrifüjle karıştırılır ve bir hücreye aktarılır.
Şekil-5'de cihazın çalışma sistemi
görülmektedir. Şekil bir santrifüjün dairesel plastik rotorunun kesitidir.
Rotorda 17 çift kompartıman vardır, bunlar dönme ekseni etrafına radyal olarak
yerleştirilmişlerdir. Örnekler ve kimyasal maddeler 16 kompartımana otomatik
olarak alınır; 17. kompartımana solvent (örneğin çözüldüğü) ve kimyasal madde
konur, bu kompartıman şahittir. Dönme hızı 350 rpm olacak şekilde rotor
döndürülür, 17. kompartmandaki her karışım iyice karışır ve reaksiyona girerler
ve rotorun dış kenarında bulunan hücrelere taşınırlar. Hücrelerde yatay kuvartz
camlar vardır. Karıştırma karışımlara hava çekilerek çabuklaştırılır. Bir
filitreli fotometre veya spektrofotometreden gelen ışın hücreden geçirilir ve
fotomultipier bir tüpe gönderilir.
Santrifüjlü hızlı analizörün en
önemli uygulama yeri enzim analizleridir. Enzim analizleri, absorbsiyon
yapabilen bir maddenin harcanması (veya oluşması) reaksiyonunda analitin
(enzim) katalitik etkisi esasına dayanır. Burada, absorbsiyon yapabilen bir
maddenin harcanması (veya oluşması) hızının enzim konsantrasyonuna göre
değişimini gösteren bir kalibrasyon eğrisinden yararlanılır. Santrifüjlü hızlı
analizör ile, aynı koşullar altında, aynı anda 16 ayrı reaksiyonun hızı saptanabilir.
