UV - Görünür Spektroskopi; Fotometrik ve Spektrofotometrik Analizler (photometric and spectrophotometric analysis)


FOTOMETRİK TİTRASYONLAR

Fotometrik ve spektrofotometrik ölçmeler bir titrasyonun son noktasını saptamakta kullanılabilir. Doğrudan yapılan bir fotometrik titrasyonda son nokta, reaksiyona giren maddenin(titrant) veya reaksiyondan elde edilen maddenin (ürün) veya her ikisinin birden konsantrasyonundaki değişikliğin sonucudur; bu maddelerden en az birinin belirli bir dalga boyunda ışın absorblaması gerekir. Doğrudan titrasyonda titrant hacmine göre indikatörün absorbansı izlenir.

Titrasyon Eğrileri

Fotometrik bir titrasyon eğrisi, düzeltilmiş absorbans değerlerinin titrant hacmine göre çizildiği bir grafiktir. Özel koşullarda, elde edilen grafikte eğimleri birbirinden farklı iki düz-hat bulunur, biri tirasyonun başlangıcında, diğeri ise eşdeğerlik noktasından sonraki kısmında bulunur; son nokta, iki doğrunun ektrapolasyonu ile elde edilen kesişme noktasıdır. Şekil-1a, ışın absorblamayan bir maddenin renkli bir titrant ile titrasyonunu gösterir. Madde ile titrantın reaksiyonu renksiz bir ürün verir ve titrasyon eğrisinin birinci bölümü yatay bir doğru şeklindedir. Eşdeğerlik noktasından sonra absorbans hızla artar (titrantın rengi nedeniyle geçirgenlik azalır). Şekil-1b ise örnek ve titrantın renksiz, reaksiyonda oluşan ürünün renkli olduğu bir titrasyon eğrisidir. Titrasyonun başlangıcından itibaren renkli ürün oluşumu nedeniyle absorbans artar, eşdeğerlik noktasından sonra absorbans titrant miktarından etkilenmez ve eğrinin ikinci yarısı yatay bir doğru şeklini alır. Örnek, titrant ve ürünün özelliklerine bağlı olarak Şekil-1'deki diğer eğriler (c, e, f) elde edilebilir.

İyi bir fotometrik eşdeğerlik noktası elde edebilmek için absorblayıcı sistemin (veya sistemlerin) Beer kanununa uyması gerekir; aksi halde, titrasyon eğrisindeki iki doğrusal bölge düzgünlüğünü kaybeder ve son nokta için gerekli olan ekstrapolasyon yapılamaz.
Diğer bir konu, absorbans değerlerinin hacim değişikliğine göre düzeltilmesidir. Bunun için gözlenen absorbans değerleri ile, V = örneğin titrasyondan önceki hacmini, v = ilave edilen titrant hacmini gösterdiğine göre, Adüzeltilmiş  hesaplanır.

Şekil-1: Tipik fotometrik titrasyon eğrileri; titre edilen örneğin, ürünün ve titrantın molar absorbtiviteleri sırasıyla, es, ep, et ile gösterilmiştir

Cihaz

Fotometrik titrasyonlar, ışık yolu üzerine bir titrasyon kabı yerleştirilebilecek şekilde dizayn edilmiş herhangi bir fotometre veya spektrofotometrede yapılabilir. Cihazda sıfır ayarı yapıldıktan sonra ışının analit çözeltiden geçmesi sağlanır, uygun bir absorbans değeri okunacak şekilde kaynak şiddeti veya dedektör hassasiyeti değiştirilir. Fotometrik titrasyonda başlangıçta örneğin gerçek absorbansını ölçmeye gerek yoktur, çünkü relatif değerlerle son-nokta tayininde daha başarılı olunur. Cihazın ayarları değiştirilmeden titrasyon yapılır ve veriler toplanır.

Bir fotometrik titrasyonun yapıldığı süre boyunca ışın kaynağının gücü ve dedektör algılaması sabit kalmalıdır. Titrasyonda silindir şeklinde bir kap kullanılır. Deney sırasında kabın yeri değişmemelidir; çünkü, kabın yeri ışın yolunun uzunluğunu saptar. Filtreli fotometreler ve spektrofotomereler bu amaçla kullanılabilmektedir. Özellikle spektrofotometreler daha dar bandlar verdiğinden fotometrelere tercih edilirler.

Fotometrik Titrasyonun Uygulaması

Fotometrik titrasyonlar çoğu zaman doğrudan fotometrik analizlere göre daha doğru sonuçlar verir; çünkü son nokta bir kaç değerden elde edilir. Ayrıca örnekte diğer absorblayıcı maddelerin bulunması, titrasyonda sadece absorbans değişikliği ölçüldüğünden, tayini engellemez.

Fotometrik eşdeğerlik noktası yöntemi, verilerin eşdeğerlik-noktası bölgesinde alındığı diğer son nokta tayin metotlarından çok daha avantajlıdır. Fotometrik titrasyon reaksiyonlarında, örneğin potansiyometrik (veya indikatör) dönüm noktası titrasyonlarında olduğu gibi, denge sabitlerine gereksinim yoktur. Bu nedenle, çok seyreltik çözeltilerin bile analizi yapılabilir.

Fotometrik son nokta her tip reaksiyona uygulanabilir. Yükseltgenme-indirgenme titrasyonlarında kullanılan titrant maddelerinin çoğunun karekteristik absorbsiyon spektrumları vardır, bu nedenle fotometrik olarak saptanabilen son noktalar verirler. Fotometrik nötralizasyon titrasyonlarında asit-baz indikatörler kullanılır. Fotometrik son nokta, EDTA ve diğer kompleks yapıcı maddelerin titrasyonunda da çok avantajlıdır. Şekil-2'de bizmut(3) ve bakır(2) karışımının fotometrik titrasyon eğrisi verilmiştir. 745 nm’de katyonların da titrantın da absorbsiyonu yoktur. Titrasyonun birinci bölümünde titrant (0.1N EDTA çözeltisi) ile çok kararlı bizmut kompleksi oluşur; bu kompleks de 765 nm’de absorbsiyon yapmaz. Bu nedenle bizmut(3) iyonlarının tamamı kompleks haline dönüşünceye kadar sistemde herhangi bir absorbsiyon gözlenmez. Bakır(2) iyonlarının EDTA ile titrasyonu başladığında reaksiyon sonucu oluşan bakır kompleksi nedeniyle absorbans değeri artmaya başlar (Cu EDTA kompleksi 765 nm'deki ışını absorblar). Absorbans, çözeltideki bakır iyonları bitinceye kadar yani eşdeğerlik noktasına ulaşılıncaya kadar artar, sonraki titrant ilaveleri absorbans değerini değiştirmez. Deneyde iki güzel son nokta elde edlir.

Fotometrik son nokta çökelme titrasyonlarına da uygulanabilir; burada, ortamda asılı katı tanecikler olarak bulunan ürün gelen-ışının saçılmasına neden olarak gücünü azaltır; titrasyona bulanıklığın sabit olmasına kadar devam edilir.

Şekil-2: 2 x 10-3 N Bi+3 ve Cu+2 içeren 100 ml çözeltinin fotometrik titrasyon eğrisi; dalga boyu 745 nm


OTOMATİK FOTOMETRİK VE SPEKTROFOTOMETRİK ANALİZLER

Son yirmi yılda cihazlarda yapılan en önemli gelişme analiz sistemlerinin son derece otomatik duruma getirilmiş olmasıdır. Bu tip cihazlara en fazla gereksinim duyulan yerler, çok sayıda örneğin kısa sürede analizinin yapılması gereken klinik laboratuvarlarıdır. Bu tip cihazlar artık endüstriyel ürünlerin ve su, hava, ve zirai maddelerin rutin analizlerinde de kullanılmaktadır.

Klinik analizlerin çoğu ultraviyole veya görünür bölgede fotometrik veya spektrofotometrik ölçmelere dayanır. Otomatik sistemlerde atomik spektroskopi de kullanılabilir ve analit konsantrasyonunu ölçmek için elektroanalitik yöntemler uygulanır. Aşağıda iki otomatik sistem ve kısa açıklamalar verilmiştir.

Sürekli - Akış Analizörü

Sürekli bir analizörde tüp ve odacıklardan oluşan bir sistemden çeşitli örnekler birbiri arkasında sıra ile geçer. Bu durumda birbirini kirletmemeleri için örneklerin ayrılması ve her örnek geçişinden sonra sistemin temizlenmesi gerekir. Tehnicon Auto Analizörde (ilk ticari cihaz) örnek, titrant, ve seyrelticinin plastik tüpteki ilerleyişi peristaltik bir pompa ile yapılır. Peş peşe gelen örneklerin birbirinden ayrılması için de tüp içine hava kabarcıkları gönderilir.

Şekil-3'de kandaki maddelerden birinin analizinde kullanılan tek-kanallı bir otoanalizörün şematik diagramı verilmiştir. Örnekler otomatik olarak ve sıra ile alınır, seyreltici ve hava kabarcığı ile karıştırılır. Hava kabarcığı karışmayı kolaylaştırır ve her bir örneğin bir diğerinden ayrılmasına yardım eder. Seyreltilen örnek dializöre girer. Burada, küçük analit iyonlarının veya moleküllerinin titrant akımına geçebilmesini sağlayan membranlar vardır. Membranlardan geçemeyen kandaki büyük-protein molekülleri dializörden dışarı atılır.

Rutin kan analizi için kullanılan bir sistemde örneği seyrelten ve bir kaç kısma ayıran bir düzenek bulunur. Ayrılan her bir parça seyreltilmiş örnek, Şekil-3'dekine benzer (ayrı) kanallardan geçer. Böyle tipik bir sistemin çıkış verileri Şekil-4'de görüldüğü gibidir.

Şekil-3: Tek kanallı Technicon Autoanalizör sistemi

Şekil-4: Çok kanallı Technicon Autoanalizör’ün çıkışı

Santifüjlü Hızlı Analizör

Bu tip analizörlerde örnekteki maddelerden birinin analizi yapılır. Sisteme aynı anda 16 örnek konulabilir. Örnek ve kimyasal madde bir santrifüjle karıştırılır ve bir hücreye aktarılır.

Şekil-5'de cihazın çalışma sistemi görülmektedir. Şekil bir santrifüjün dairesel plastik rotorunun kesitidir. Rotorda 17 çift kompartıman vardır, bunlar dönme ekseni etrafına radyal olarak yerleştirilmişlerdir. Örnekler ve kimyasal maddeler 16 kompartımana otomatik olarak alınır; 17. kompartımana solvent (örneğin çözüldüğü) ve kimyasal madde konur, bu kompartıman şahittir. Dönme hızı 350 rpm olacak şekilde rotor döndürülür, 17. kompartmandaki her karışım iyice karışır ve reaksiyona girerler ve rotorun dış kenarında bulunan hücrelere taşınırlar. Hücrelerde yatay kuvartz camlar vardır. Karıştırma karışımlara hava çekilerek çabuklaştırılır. Bir filitreli fotometre veya spektrofotometreden gelen ışın hücreden geçirilir ve fotomultipier bir tüpe gönderilir.

Santrifüjlü hızlı analizörün en önemli uygulama yeri enzim analizleridir. Enzim analizleri, absorbsiyon yapabilen bir maddenin harcanması (veya oluşması) reaksiyonunda analitin (enzim) katalitik etkisi esasına dayanır. Burada, absorbsiyon yapabilen bir maddenin harcanması (veya oluşması) hızının enzim konsantrasyonuna göre değişimini gösteren bir kalibrasyon eğrisinden yararlanılır. Santrifüjlü hızlı analizör ile, aynı koşullar altında, aynı anda 16 ayrı reaksiyonun hızı saptanabilir.

 Şekil-5: Bir santrifüjlü hızlı analizörün rotoru