Kromatografi, benzer özellikteki maddelerin birbirinden
ayrılmasında uygulanan yöntemler
arasında birinci sırayı alır. Ayrıca, ayrılan maddelerin kalitatif tanımlanmasında
ve kantitatif tayininde de kullanılır. Bu bölümde tam bir analizin yapılmasında
kullanılan genel kromatografik kavramlar açıklanacaktır.
Bir kromatogram, örnekteki her bir madde hakkında çok az
bilgi verir; bunlar maddenin alıkonma zamanı veya bir sıyırma periyodu
süresince maddenin sabit fazdaki konumunu gösteren bilgilerdir. İlave bilgiler
elde edilebilmesi için hareketli ve sabit fazlar değiştirilip çeşitli sıyırma
sıcaklıkları uygulanabilir. Yine de bir madde için kromatografide alınan
veriler, IR, NMR veya kütre spektrumunda alınanlara göre oldukça azdır.
Spektral apsislerdeki veriler (l, s, veya m/e) kromatografik apsiste alınana (tR) kıyasla daha
hassastır.
Bu gerçekler kromatografinin kalitatif analizlerde başarısız
bir yöntem olduğunu göstermez. İsimleri bilinen ve çoğunlukla birarada bulunan
bazı madde karışımlarının tanımlanması yapılabilir. Örneğin, bir protein
hidroliz örneğinde 30 veya daha çok sayıdaki amino asidin varlığı veya yokluğu,
ince bir kromatografik levhada açığa çıkan görüntülerin şiddetine göre
saptanabilir. Yine de teşhisin kesin olması için ayrılan maddelerin spektral
veya kimyasal tanımına gerek vardır.
Karmaşık yapılı bir örneğin spektroskopik yöntemlerle
tanımlanması için önceden kromatografik bir ayırmaya gereksinim vardır. Yani
kalitatif spektroskopik analizlerde analizin geleceği kromatografiye bağlıdır.
Kromatografi süratli, basit, ve çok iyi bir ayırma yöntemi
olması nedeniyle son 30 yılda büyük bir alana yayılmıştır. Bunda
kromatografinin kantitatif analizlerde çok kullanılması en önemli etken
olmuştur.
Kantitatif kromatografide analit pikinin yüksekliği veya
alanı bir veya daha çok sayıdaki standartla kıyaslanır. Çalışma koşulları
kontrol edilebiliyorsa bu iki parametre de konsantrasyonla doğrusal olarak
değişir.
Pik Yüksekliğine Göre
Analiz: Bir kromatografik pikin yüksekliğini ölçmek için pikin iki
yanındaki taban çizgileri düz bir doğru ile birleştirilir ve pik tepesinden bu
doğruya bir dik inilir; dikin uzunluğu, pik yüksekliğidir. Yükseklik çok hassas
olarak ölçülebilir. Kolon koşullarını etkileyen değişkenler, örnek ve
standartların kromatogramlarının alındığı süre boyunca sabit tutulmalıdır. Çok
iyi kontrol edilmesi gereken değişkenler kolon sıcaklığı, sıyırıcının akış hızı
ve örneğin injeksiyon hızıdır. Ayrıca kolonun aşırı yüklenmemesine de dikkat
edilmesi gerekir. Örnek injeksiyon hızı bir kromatogramda ilk çıkan pikler için
önemlidir ve % 5-10 'a kadar ulaşan relatif hatalara yol açar.
Pik Alanlarına Göre
Analiz: Yukarıdaki paragrafta belirtilen değişkenler pik alanında genişleme
etkisi yapmazlar. Bu bakımdan alana göre yapılan analizler yüksekliğe göre
yapılanlara kıyasla daha yeterlidir. Diğer yönden pik yüksekliklerin ölçülmesi
daha kolaydır ve dar piklerde bu yöntemle daha doğru sonuçlar alınır.
Modern kromatografi cihazlarında bilya ve disk veya
elektronik bilgisayarlar vardır. Bunlarda pik alanları hassas olarak
ölçülebilir. Bu tip sistemlerin olmaması durumunda hesaplamalar el ile yapılır.
Uygun genişlikteki simetrik piklerde alan basit bir yöntemle hesaplanır; pikin
yüksekliği, yüksekliğin tam ortasından çizilen yatay doğrunun uzunluğu (o
noktadaki pik genişliği) ile çarpılır. Pik alanı pikin bir planimetre ile
taranmasıyla da bulunabilir. Bir başka yöntem de pikin kesilerek tartılması ve
tartımın, ayni kaydedici kağıdın alanı bilinen bir parçasının ağırlığı ile
kıyaslanmasıdır. McNair ve Bonelli, 10 örnek üzerinde bu yöntemlerin hassasiyetlerini
inceleyen bir çalışma yapmışlardır. Çalışma sonuçlarına göre aşağıdaki standart
sapmalar belirlenmiştir.
Standartlarla Yapılan
Kalibrasyon: Kantitatif kromatografik analizde en çok uygulanan yöntem
örnekteki maddelerin bileşimine yakın bileşimlerdeki bir seri standart çözelti
ile çalışılmasıdır. Standartların kromatogramları alınarak pik yüksekliklerinin
veya alanlarının, madde konsantrasyonlarına göre " kalibrasyon grafiği"
çizilir; grafik orijinden geçen bir doğru şeklindedir. Örneğin analizi bu
grafiğe göre yapılır. Yüksek hassasiyet alınabilmesi için standart çözeltilerin
ve kalibrasyon grafiğinin sık sık kontrol edilmesi gerekir.
Analizdeki en önemli hata kaynağı, injekte edilen standart
ve analit örnek hacminin tam sabit olamayışıdır; ayrıca injeksiyon hızı da
hataya neden olan bir faktördür. Örnek miktarı çoğunlukla 1 mikrolitre gibi çok
az miktarlardır ve her defasında ayni hacimde madde verebilmek için bir mikro
şırınga kullanılarak relatif hata % birkaç seviyesine kadar düşürülebilir. Bu
hata gaz-sıvı kromatografisinde daha da büyüktür; örnek sıcak bir uçtan injekte
edildiğinde, şırınga ucundaki buharlaşma kolona verilen madde hacminde büyük
farklılıklar olmasına yol açar.
Örnek hacmindeki hatalar, Şekil-10'da görülen bir
"döner gaz örnek valfi ile verilen miktarın % 1-2'sine kadar
düşürülebilir. (a)'daki örnek yuvası örnekle doldurulur; valfin 450
döndürülmesiyle yuvadaki örnekten belirli bir miktarı hareketli faz akımı içine
verilir.
Şekil-10:
Döner bir örnek valfi; (a) örnek yuvası ABC ‘nin doldurulduğu valf konumu, (b)
örneğin kolona verilmesi
İç Standart yöntemi: Kantitatif
kromatografide en hassas sonuçlar örnek injeksiyonundan kaynaklanan hataların
bulunmadığı iç standart yöntemi ile elde edilir. Bu yöntemde örnek ve
standartlara çok hassas tartılmış bir iç standart maddesi ilave edilir; analit
pik alanının (veya yüksekliğinin) iç standart pik alanına (veya yüksekliğine)
oranı analitik parametre olarak kullanılır. Yöntemin başarılı olabilmesi için
iç standart pikinin ötnekdeki diğer maddelerin piklerinden uzakta (RS >
1.25), analit pikinin yakınında olması gerekir. Uygun bir iç standart
kullanıldığında relatif hata %0.5-1 civarındadır.
Alan Normalizasyonu
Yöntemi: Örnek injeksiyonundaki düzensizliğin yaratığı hata alan
normalizasyonu ile de giderilebilir. Bu yöntemde örnekteki tüm maddelerin
kolondan çıkması gerekir. Kromatogramdaki tüm piklerin alanları hesaplanır ve
her madde için bilinen detektör algılama faktörü ile çarpılarak düzeltilir.
Analitin konsantrasyonu, analit pikine ait alanın toplam pik alanlarına
bölünmesiyle hesaplanır. Aşağıda bu yöntemdeki hesaplamalara bir örnek
verilmiştir.
Aşağıdaki veriler butil-alkoller karışımı bir örneğin
kromatogramından alınmıştır (detektör hassasiyeti düzeltme faktörleri bilinen
miktarlarda saf alkoller kullanılarak ayrı deneylerde saptanmıştır).
Modern kromatografi cihazlarında kolon sıcaklığı, sıyırıcı
akış hızı, örnek injeksiyon zamanı ve örnek sıcaklığı gibi parametreler "
mikroprosesör" lerle kontrol edilir. Bunlarda kişiler tarafından yapılan hiç
bir kontrol yoktur veya çok azdır. Cihazlar çok karmaşık fakat son derece
otomatiktir. Örnekler (bir kaç düzine olabilir) dönen bir sistem içine konur.
Her analizden sonra kolon otomatik olarak başlangıç noktası gelir, döner örnek
tablası da yeni bir örneği kolonun önüne getirecek şekilde döner, örnek
otomatik olarak çekilir ve kolona injekte edilir, ktomatogramı alınır ve bir
bilgisayar hafızasına yerleştirilir. Veriler kromatogram ve tablo şeklinde
alınır; tabloda alıkonma zamanları, relatif pik alanları ve bazılarında her
pikin hangi bileşiğe ait olduğu da kaydedilir.
Şekil-11:
Bir kromatografi hesaplama integratörü
