Fotometrik ve spektrofotometrik ölçmeler bir titrasyonun son
noktasını saptamakta kullanılabilir. Doğrudan yapılan bir fotometrik
titrasyonda son nokta, reaksiyona giren maddenin(titrant) veya reaksiyondan
elde edilen maddenin (ürün) veya her ikisinin birden konsantrasyonundaki
değişikliğin sonucudur; bu maddelerden en az birinin belirli bir dalga boyunda
ışın absorblaması gerekir. Doğrudan titrasyonda titrant hacmine göre
indikatörün absorbansı izlenir.
Titrasyon
Eğrileri: Fotometrik bir
titrasyon eğrisi, düzeltilmiş absorbans değerlerinin titrant hacmine göre
çizildiği bir grafiktir. Özel koşullarda, elde edilen grafikte eğimleri
birbirinden farklı iki düz-hat bulunur, biri tirasyonun başlangıcında, diğeri
ise eşdeğerlik noktasından sonraki kısmında bulunur; son nokta, iki doğrunun
ektrapolasyonu ile elde edilen kesişme noktasıdır.
Şekil-22a, ışın absorblamayan bir maddenin renkli bir
titrant ile titrasyonunu gösterir. Madde ile titrantın reaksiyonu renksiz bir
ürün verir ve titrasyon eğrisinin birinci bölümü yatay bir doğru şeklindedir.
Eşdeğerlik noktasından sonra absorbans hızla artar (titrantın rengi nedeniyle
geçirgenlik azalır). Şekil-22b ise örnek ve titrantın renksiz, reaksiyonda
oluşan ürünün renkli olduğu bir titrasyon eğrisidir. Titrasyonun başlangıcından
itibaren renkli ürün oluşumu nedeniyle absorbans artar, eşdeğerlik noktasından
sonra absorbans titrant miktarından etkilenmez ve eğrinin ikinci yarısı yatay
bir doğru şeklini alır. Örnek, titrant ve ürünün özelliklerine bağlı olarak
Şekil-22'deki diğer eğriler (c, e, f) elde edilebilir.
İyi bir fotometrik eşdeğerlik noktası elde edebilmek için
absorblayıcı sistemin (veya sistemlerin) Beer kanununa uyması gerekir; aksi
halde, titrasyon eğrisindeki iki doğrusal bölge düzgünlüğünü kaybeder ve son
nokta için gerekli olan ekstrapolasyon yapılamaz.
Diğer bir konu, absorbans değerlerinin hacim değişikliğine
göre düzeltilmesidir. Bunun için gözlenen absorbans değerleri ile, V = örneğin
titrasyondan önceki hacmini, v = ilave edilen titrant hacmini gösterdiğine
göre, Adüzeltilmiş hesaplanır.
Şekil-22:
Tipik fotometrik titrasyon eğrileri; titre edilen örneğin, ürünün ve titrantın
molar absorbtiviteleri sırasıyla, es, ep, et
ile gösterilmiştir
Cihaz
Fotometrik titrasyonlar, ışık yolu üzerine bir titrasyon
kabı yerleştirilebilecek şekilde dizayn edilmiş herhangi bir fotometre veya
spektrofotometrede yapılabilir. Cihazda sıfır ayarı yapıldıktan sonra ışının
analit çözeltiden geçmesi sağlanır, uygun bir absorbans değeri okunacak şekilde
kaynak şiddeti veya dedektör hassasiyeti değiştirilir. Fotometrik titrasyonda
başlangıçta örneğin gerçek absorbansını ölçmeye gerek yoktur, çünkü relatif
değerlerle son-nokta tayininde daha başarılı olunur. Cihazın ayarları
değiştirilmeden titrasyon yapılır ve veriler toplanır.
Bir fotometrik titrasyonun yapıldığı süre boyunca ışın
kaynağının gücü ve dedektör algılaması sabit kalmalıdır. Titrasyonda silindir
şeklinde bir kap kullanılır. Deney sırasında kabın yeri değişmemelidir; çünkü,
kabın yeri ışın yolunun uzunluğunu saptar. Filtreli fotometreler ve
spektrofotomereler bu amaçla kullanılabilmektedir. Özellikle
spektrofotometreler daha dar bandlar verdiğinden fotometrelere tercih
edilirler.
1.
Fotometrik Titrasyonun Uygulaması
Fotometrik titrasyonlar çoğu zaman doğrudan fotometrik
analizlere göre daha doğru sonuçlar verir; çünkü son nokta bir kaç değerden
elde edilir. Ayrıca örnekte diğer absorblayıcı maddelerin bulunması,
titrasyonda sadece absorbans değişikliği ölçüldüğünden, tayini engellemez.
Fotometrik eşdeğerlik noktası yöntemi, verilerin
eşdeğerlik-noktası bölgesinde alındığı diğer son nokta tayin metotlarından çok
daha avantajlıdır. Fotometrik titrasyon reaksiyonlarında, örneğin
potansiyometrik (veya indikatör) dönüm noktası titrasyonlarında olduğu gibi,
denge sabitlerine gereksinim yoktur. Bu nedenle, çok seyreltik çözeltilerin
bile analizi yapılabilir.
Fotometrik son nokta her tip reaksiyona uygulanabilir.
Yükseltgenme-indirgenme titrasyonlarında kullanılan titrant maddelerinin çoğunun
karekteristik absorbsiyon spektrumları vardır, bu nedenle fotometrik olarak
saptanabilen son noktalar verirler. Fotometrik nötralizasyon titrasyonlarında
asit-baz indikatörler kullanılır. Fotometrik son nokta, EDTA ve diğer kompleks
yapıcı maddelerin titrasyonunda da çok avantajlıdır. Şekil-23'de bizmut(3) ve
bakır(2) karışımının fotometrik titrasyon eğrisi verilmiştir. 745 nm’de
katyonların da titrantın da absorbsiyonu yoktur. Titrasyonun birinci bölümünde
titrant (0.1N EDTA çözeltisi) ile çok kararlı bizmut kompleksi oluşur; bu
kompleks de 765 nm’de absorbsiyon yapmaz. Bu nedenle bizmut(3) iyonlarının
tamamı kompleks haline dönüşünceye kadar sistemde herhangi bir absorbsiyon
gözlenmez. Bakır(2) iyonlarının EDTA ile titrasyonu başladığında reaksiyon sonucu
oluşan bakır kompleksi nedeniyle absorbans değeri artmaya başlar (Cu EDTA
kompleksi 765 nm'deki ışını absorblar). Absorbans, çözeltideki bakır iyonları
bitinceye kadar yani eşdeğerlik noktasına ulaşılıncaya kadar artar, sonraki
titrant ilaveleri absorbans değerini değiştirmez. Deneyde iki güzel son nokta
elde edlir.
Fotometrik son nokta çökelme titrasyonlarına da
uygulanabilir; burada, ortamda asılı katı tanecikler olarak bulunan ürün
gelen-ışının saçılmasına neden olarak gücünü azaltır; titrasyona bulanıklığın
sabit olmasına kadar devam edilir.
Şekil-23: 2 x 10-3
N Bi+3 ve Cu+2 içeren 100 ml çözeltinin fotometrik
titrasyon eğrisi; dalga boyu 745 nm
2.
Otomatik Fotometrik ve Spektrofotometrik Analizler
Son yirmi yılda cihazlarda yapılan en önemli gelişme analiz
sistemlerinin son derece otomatik duruma getirilmiş olmasıdır. Bu tip cihazlara
en fazla gereksinim duyulan yerler, çok sayıda örneğin kısa sürede analizinin
yapılması gereken klinik laboratuvarlarıdır. Bu tip cihazlar artık endüstriyel
ürünlerin ve su, hava, ve zirai maddelerin rutin analizlerinde de
kullanılmaktadır.
Klinik analizlerin çoğu ultraviyole veya görünür bölgede
fotometrik veya spektrofotometrik ölçmelere dayanır. Otomatik sistemlerde
atomik spektroskopi de kullanılabilir ve analit konsantrasyonunu ölçmek için
elektroanalitik yöntemler uygulanır. Aşağıda iki otomatik sistem ve kısa
açıklamalar verilmiştir.
Sürekli
- Akış Analizörü: Sürekli
bir analizörde tüp ve odacıklardan oluşan bir sistemden çeşitli örnekler
birbiri arkasında sıra ile geçer. Bu durumda birbirini kirletmemeleri için
örneklerin ayrılması ve her örnek geçişinden sonra sistemin temizlenmesi
gerekir. Tehnicon Auto Analizörde (ilk ticari cihaz) örnek, titrant, ve
seyrelticinin plastik tüpteki ilerleyişi peristaltik bir pompa ile yapılır. Peş
peşe gelen örneklerin birbirinden ayrılması için de tüp içine hava kabarcıkları
gönderilir.
Şekil-24'de kandaki maddelerden birinin analizinde
kullanılan tek-kanallı bir otoanalizörün şematik diagramı verilmiştir. Örnekler
otomatik olarak ve sıra ile alınır, seyreltici ve hava kabarcığı ile
karıştırılır. Hava kabarcığı karışmayı kolaylaştırır ve her bir örneğin bir
diğerinden ayrılmasına yardım eder. Seyreltilen örnek dializöre girer. Burada,
küçük analit iyonlarının veya moleküllerinin titrant akımına geçebilmesini
sağlayan membranlar vardır. Membranlardan geçemeyen kandaki büyük-protein
molekülleri dializörden dışarı atılır.
Rutin kan analizi için kullanılan bir sistemde örneği
seyrelten ve bir kaç kısma ayıran bir düzenek bulunur. Ayrılan her bir parça
seyreltilmiş örnek, Şekil-24'dekine benzer (ayrı) kanallardan geçer. Böyle
tipik bir sistemin çıkış verileri Şekil-25'de görüldüğü gibidir.
Santifüjlü
Hızlı Analizör: Bu tip
analizörlerde örnekteki maddelerden birinin analizi yapılır. Sisteme aynı anda
16 örnek konulabilir. Örnek ve kimyasal madde bir santrifüjle karıştırılır ve
bir hücreye aktarılır.
Şekil-26'da cihazın çalışma sistemi görülmektedir. Şekil bir
santrifüjün dairesel plastik rotorunun kesitidir. Rotorda 17 çift kompartıman
vardır, bunlar dönme ekseni etrafına radyal olarak yerleştirilmişlerdir.
Örnekler ve kimyasal maddeler 16 kompartımana otomatik olarak alınır; 17.
kompartımana solvent (örneğin çözüldüğü) ve kimyasal madde konur, bu
kompartıman şahittir.
Şekil-24:
Tek kanallı Technicon Autoanalizör sistemi
Şekil-25:
Çok kanallı Technicon Autoanalizör’ün çıkışı
Dönme hızı 350 rpm olacak şekilde rotor döndürülür, 17.
kompartmandaki her karışım iyice karışır ve reaksiyona girerler ve rotorun dış
kenarında bulunan hücrelere taşınırlar. Hücrelerde yatay kuvartz camlar vardır.
Karıştırma karışımlara hava çekilerek çabuklaştırılır. Bir filitreli fotometre
veya spektrofotometreden gelen ışın hücreden geçirilir ve fotomultipier bir
tüpe gönderilir.
Santrifüjlü hızlı analizörün en önemli uygulama yeri enzim
analizleridir. Enzim analizleri, absorbsiyon yapabilen bir maddenin harcanması
(veya oluşması) reaksiyonunda analitin (enzim) katalitik etkisi esasına
dayanır. Burada, absorbsiyon yapabilen bir maddenin harcanması (veya oluşması)
hızının enzim konsantrasyonuna göre değişimini gösteren bir kalibrasyon
eğrisinden yararlanılır. Santrifüjlü hızlı analizör ile, aynı koşullar altında,
aynı anda 16 ayrı reaksiyonun hızı saptanabilir.
Şekil-26: Bir
santrifüjlü hızlı analizörün rotoru
