Düzlem kromatografisi iki tiptir. Bunlardan biri ince-tabaka
kromatografisidir; ayırma, düz bir yüzey üzerinde bulunan ince toz halindeki
katı bir tabakada da yapılır. Diğeri kağıt kromatografisidir; burada ayırma
ortamı, ağır bir filtre kağıdından yapılmış bir şerit veya sayfadır.
Kağıt kromatografisi ilk olarak 19. yüzyılın ortalarında
kullanılmıştır. 1940'lı yıllarda çeşitli sahalara uygulanabilen bir teknik
olarak geliştirilmiştir. İnce-tabaka kromatografisinin gelişmesi 1950
yıllarında olmuş ve kısa sürede diğerinden daha çok kullanım alanına
yayılmıştır. Kağıt ve ince-tabaka kromatografileri kompleks inorganik, organik,
ve biyokimyasal maddeleri ayırma ve tanımlamada kullanılan basit ve ucuz
yöntemlerdir. Hatta (özellikle ince tabaka kromatografisi), bu tip karışımların
kantitatif analizlerinde bile kullanılabilirler.
Düzlem kromatografide, örneğin bulunduğu bir damla çözelti
sabit fazın düzlem yüzeyi üzerinde bir noktaya damlatılır. Çözgenin
buharlaşmasından sonra, yüzey boyunca hareketli bir faz (yıkayıcı, developer)
akışıyla kromatogram yıkanır. Yıkayıcının hareketini kapiler kuvvetler sağlar.
"Yukarı yıkama"da hareketli faz yukarı doğru gider; radyal yıkamada
yıkayıcı bir merkezden başlayarak daireler halinde ilerler. "Aşağı
yıkama"da hareket aşağı doğrudur, bunda solventin akışına ağırlığı da
yardımcı olur.
Düzlem kromatografisinde denge konumu, kullanılan sıvı-sıvı
tipine bağlı olarak değişir. Çoğunlukla sabit faz su veya polar başka bir
sıvıdır. Kolon kromatografisinde ilk geliştirilen ilkeler kağıt ve ince-tabaka
ortamlarına da uygulanabilir. Bu ortamlar içinde sabit ve hareketli fazlar
arasında tekrar tekrar madde transferi lolur. Maddenin hareket hızı dağılma
katsayısına bağlıdır.
Tek bir taneciğin fazlar arasında gezinmesi, taneciğin gecikme fatörü (R F ) ile tanmlanır.,
Kontrol edilemeyen değişkenleri dengeleyebilmek için bir
maddenin dolaştığı mesafe, aynı koşullarda standart bir maddeninki ile
kıyaslanır. Bu iki mesafe arasındaki oran R std
şeklinde tanımlanır.
Sabit Faz: İnce-tabaka
kromatografisinde kullanılan katı adsorblayıcılar, kimyasal bileşim ve tanecik
büyüklüğü bakımından çeşitli tipteki kolon kromatografilerinde kullanılananlara
benzer. Ençok kullanılan adsorblayıcı, sıvı- sıvı ayırmasında su veya diğer
polar çözgenler için bir destek malzemesi görevi yapan silikajel'dir.
Hazırladıktan sonra kurutulan silika tabakası neminin çoğunu kaybedip katı bir
tabaka haline dönüştürülerek sıvı-katı ayırmalarında da kullanılabilir. Böyle
bir kurutma işlemi yapılırken silika yüzeyinin atmosfere açık olmamasına dikkat
edilmelidir; aksi halde yüzey birkaç dakika içinde tekrar nem çekerek destek
malzemesinin (silika jel) sıvı-sıvı ayırması yapabilecek şekle dönüşmesine
neden olur.
İyon değiştirici reçineler ve Sephadex jelleri de
ince-tabaka kromatografisinde sabit faz olarak kullanılabilirler.
İnce-Tabaka
levhalarının Hazırlanması: Bir ince-tabaka levhası bir cam veya
"mylar" levhası veya mikroskop kızağı üzerine, çok ince toz halindeki
katı maddenin sulu bir karışımı (çamur) yayılarak hazırlanır. Katı taneciklerin
levha üzerine ve birbirine tutunması için karışım içine, çoğunlukla, bir
bağlayıcı konulur, karışımın levha üzerinde yayılması ve yüzeye sıkıca
yerleşmesi için levha bir süre bekletilir; bazan da bir etüvde bir kaç saat
ısıtılır.
İnce tabaka üzerinde maddelerin iyi ve temiz bir şekilde
ayrılabilmesi, levhanın kaplandığı maddenin tanecik büyüklüğü dağılımına ve
tabaka kalınlığının düzgünlüğüne bağlıdır. Sabit kalınlıkta bir tabaka
oluşturmak için çeşitli sürme yöntemleri geliştirilmiştir. Çeşitli firmalar
kaplanmış halde levhalar pazarlamaktadır.
Levhanın Develope
Edilmesi: İnce-tabaka levhalarının develope edilmesinde uygulanan işlemler
Şekil-26’da gösterilmiştir. Levhalar, çoğunlukla, 5x20x20 cm. boyutlarındadır.
Levhanın bir ucu yakınına bir damla örnek konur ve yeri bir kalem ile
işaretlenir. Örneğin çözücüsü buharlaştırılır ve levha, develope edecek madde
buharları ile doyurulmuş kapalı bir kap içine konur. Levhanın bir ucu, Şekil-26’daki
yöntemlerden birine göre, develop çözücüsüyle nemlendirilir (örnek develop solventine
daldırılır). Developer levhanın tümünü geçtikten sonra levha çıkarılır, kurutulur
ve üzerinde ayrılmış olan maddeler uygun bir yöntemle tanımlanır.
Şekil-27'de, bir karışımdaki amino asitlerin iki yönde
develope edilerek ayrılması görülmektedir (iki-yönlü düzlem kromatografisi).
Örnek kare şeklindeki levhanın bir köşesine konur ve önce A çözücüsü kullanılarak
yukarı akış yöntemiyle develope edilir. B çözücüsü konulur ve tekrar yukarı
akış ile develop edilir. B çözücüsü de uzaklaştırıldıktan sonra levhaya, amino
asitlerle pembeden mora kadar değişen renkler oluşturan ninhidrin maddesi
yayılarak amino asitlerin konumları belirlenir. Saptanan lekeler, standart
örneklerdeki amino asitlerin konumları ile kıyaslanarak tehşis edilir.
Şekil-26:
İnce tabaka kromatografisi için üç tip sistem; (a) yukarı akışlı, (b) aşağı
akışlı, (c) yatay akışlı, S: örneğin başlangıçtaki konumu, D: developer, C:
kromatografik yüzey, W: pamuk fitil
Şekil-27: Bazı amino
asitlerin iki yönlü ince-tabaka kromatogramı; A: toluen-2-kloroetanol-pridin,
B: kloroform-benzil alkol-asetik asit
Taneciklerin
Tanımlanması: Ayırma işleminden sonra örnekteki maddelerin yerlerini
belirlemek için çeşitli yöntemler uygulanır. Bunlardan en çok kullanılan ve pek
çok organik karışımlarda uygulanabilen iki yöntemde iyod veya sülfürik asit
çözeltileri kullanılır. Çözelti levha üzerine yayıldığında organik maddelerle
koyu renkli ürünler vererek reaksiyona girer. Ninhidrin gibi bazı özel maddeler
de kullanılabilir. Ayrılma işleminde fluoresans maddeler oluşuyorsa bunların
tanımlanması UV bir lamba ile yapılabilir; veya, sabit faza fluoresans bir
madde konularak develope işleminden sonra levha UV bir lamba altında
incelenebilir.
Kantitatif Analiz: Levha
üzerinde açığa çıkan leke alanlarını daha önce hazırlanmış olan standartların
alanlarıyla kıyaslayarak yarı kantitatif sonuçlar alınabilir. Daha iyi ve
hassas sonuçlar için levha üzerindeki leke kazınarak alınır, ekstraksiyon ile
madde katı kısımdan ayrılır ve uygun bir fiziksel veya kimyasal yöntemle analiz
edilir. Bir başka metot da lekeden, fluoresans veya yansıma yoluyla çıkan
ışının bir densitometre ile ölçülmesidir.
Kağıt kromatografisi ile yapılan ayırmalar ince-tabaka
levhalarına benzer şekildedir. Burada çok saf, porozitesi ve kalınlığı düzgün
ve ayni kaliteli kağıtlar kullanılır. Bu kağıtlar yeterli miktarda su
adsorblanmışlardır ve sıvı-sıvı tip kromatografi sınıfında bulunurlar. Su
yerine başka sıvıları adsorblamış kağıtlar da olabilir, bunlarda sabit faz
farklıdır. Örneğin, silikon yağı veya parafin ile işlem görmüş bir kağıtla,
ters-faz kağıt kromatografisi yapılabilir; bunda hareketli faz polar bir solventtir.
Bir adsorbent veya iyon-değiştirici reçine içeren özel kağıtlar da vardır;
bunlar adsorbsiyon ve iyon-değiştirici kağıt kromatografisi olarak kullanılır.
