Klasik sıvı kromatografisi yönteminde çapı 10-50 mm olan ve
50-500 cm uzunluğunda katı sabit faz malzemesi içeren cam tüpler kullanılır.
Uygun bir akış hızı alınabilmesi için katı malzemenin tanecik büyüklüğünün
150-200 mikrometreden fazla olması gerekir. Dolgu maddesinin yukarısındaki
sıvının yüksekliği hareketli fazı kolon boyunca yürütebilecek seviyede
olmalıdır. En iyi akış hızı dakikada bir
mililitrenin onda bir kaçı kadardır ve tabii ayırma işleminde harcanan zaman da
fazla olur.
Klasik uygulamanın çabuklaştırılması için sıvı akış hızının
vakumla çekilerek veya pompa ile ittirilerek hızlandırılması olumlu sonuçlar
vermez, çünkü istenilen hızlardaki tepsi yükseklikleri, Şekil-7’de verilen
eğrinin minimumundan sonraki bölgeye düşer ve yüksek değerler alır; tepsi
yüksekliğinin artması ise verimi düşürür.
Sıvı kromatografisinin uygulanmaya başlandığı ilk yıllarda
kolon veriminin, dolgu maddesinin tanecik boyutları küçültülerek önemli
derecede artırılabileceği düşünülmüştür. 1960 yıllarında çapı 10 mikrometre
gibi çok küçük taneciklerin üretildiği ve kullanıldığı yeni bir teknoloji
geliştirilmiştir. Bu teknolojide, klasik sıvı kromatografisinde kullanılan
basit sistemlerin tersine çok karmaşık cihazlara gereksinim vardır.
"Yüksek-performanslı sıvı kromatografisi, HPLC (highperformance liquid
chromatography)" denilen bu tip cihazlar klasik kromatografilerde
yapılamayan uygulamalarda çok başarılıdır.
Şekil-12'de, deneyle elde edilen bir sıvı kromatografisi
verilerinin grafikleri verilmiştir; şekilde tepsi yüksekliğinin, akış hızı ve
dolgu maddesinin tanecik çapına göre değişimleri görülmektedir. Eğrilerin hiç
birinde, Şekil-7’ deki gibi bir minimum yoktur; sıvı kromatografisinde bu tip
minimumlarla sadece çok düşük akış hızlarında karşılaşılır. Yine aynı konuda
görülen denklem(8), verim ile hareketli faz arasındaki ilişkiyi yeteri derecede
tanımlayamaz; burada, Giddings tarafından çıkarılan daha kompleks bir denklem
kullanılır (J.C Gidings, Anal. Chem., 35, 1338, 1963).
Şekil-12'de ayırma veriminin, küçük tanecik çaplarında çok
arttığı açık bir şekilde görülmekledir. Bu tip maddelerle hazırlanan kolonlarda
uygun akış hızları, yüksek basınçlı pompa ile sağlanabilmiştir. Bu da HPLC
cihazındaki sistemin klasik sıvı kromatografisinde kullanılan yükleme (kendi
ağırlığı ile) kolonuna göre çok daha ayrıntılı ve karmaşık olduğunu gösterir.
Şekil-13'de böyle bir cihazın bölümlerinin gösterildiği bir blok diyagram
verilmiştir. Bu bölümlerin her biri aşağıda ayrı ayrı ele alınmıştır.
Şekil-12:
Dolgu maddesi tanecik büyüklüğünün ve akış hızının tepsi yüksekliğine (H)
etkisi. Kolon boyutları 30 cm x 2.4 mm dir; madde N,N-dietil-p-aminobenzen,
hareketli faz heksan, metilen klorür ve izopropil alkoldür; dolgu maddesi
corosil II ince slikajel
Şekil-13:
Tipik bir sıvı kromatografisi cihazında sıvı akışını gösteren şematik diyagramı
Çözgen (Solvent)
Rezervuarı ve Gaz Giderme Sistemi: Modern bir HPLC cihazında, her biri 1-2
lt kapasiteli bir veya daha fazla cam veya paslanmaz çelik rezervuarlar
bulunur. Rezervuarlarda çözünmüş gazları, çoğunlukla oksijen ve azotu,
giderecek düzenekler vardır. Bu gibi gazlar kolonda ve dedektör sistemlerinde
kabarcıklar oluşturarak çalışmayı bozarlar; band genişlemesine ve dedektörün
algılama bozukluğuna neden olurlar. Gaz giderici düzeneklerde bir vakum pompa
sistemi, bir distilasyon sistemi veya Çözgeni ısıtan ve karıştıran bir sistem
bulunur.
Tek bir çözgenin kullanıldığı ayırmaya "tek kaynaklı
(isokratik) sıyırma" denir. Polariteleri birbirinden önemli derecede
farklı olan iki (bazan daha çok) çözgenin kullanıldığı ve "dereceli
sıyırma (gradient)" adı verilen yöntemde ayırma verimi oldukça yüksektir.
Sıyırma işlemi başlatıldıktan sonra iki çözgenin oranları programlı bir şekilde
değiştirilir; değiştirme bazan sürekli, bazan da kademeli olarak yapılır.
Modern HPLC cihazlarında, iki veya daha fazla rezervuardan bir karıştırma
odacığına sürekli olarak değişen hızlarda çözgen verilir; Çözgenlerin hacimleri
arasındaki oran zamanla doğrusal veya üstel fonksiyon olarak değiştirilebilir.
Şekil-14'de dereceli sıyırma işlemi ile yapılan iyi bir
ayırma görülmektedir. 3b' deki kromatogramda sıyırmada hacimce 50/50 metanol/su
çözeltisi kullanılmıştır. 3a'daki kromatogramda ise ayni çözgen çifti
sıyırmanın başlangıcında 40/50 oranında olacak ve sonra metanol oranı dakikada
% 8 hızla artacak şekilde bir uygulama yapılmıştır. Dereceli sıyırma yöntemiyle
yapılan ayırmalarda, ilk çıkan piklerde herhangi bir bozulma olmaksızın ayırma
süresi kısaltılabilir.
Şekil-14:
Kademeli sıyırma ile ayırma veriminin artırılması; (a) dereceli sıyırma
(b) tek kaynaklı sıyırma
Pompalar: HPLC
cihazlarının çoğundaki pompaların çıkış basıncı 1000 psi (libre/inc2)
den büyüktür, dakikada 3 ml hızla akış sağlayan 4000-6000 psi lik pompalar
tercih edilir. Akış hızı ± % 2 lik bir toleransla sabit olmalıdır. Bu amaçla kullanılabilen
iki mekanik pompa tipi vardır; bunlardan biri vida-yürütücülü (Screw-driven)
şırınga tipi pompa, diğeri pistonlu pompadır. Birinci tip pompalarda kolaylıkla
kontrol edilebilen, darbesiz bir akım alınır; ancak kapasitede düşme ve çözgen
oranlarının değiştirilmesinde sorunlarla karşılaşılır. Pistonlu pompaların kullanım
alanları daha geniştir, kademeli olarak azaltılan miktarlarda darbeli bir akım
verir. Pistonlu pompaların avantajı istenildiği kadar çözgen basabilmesidir;
ayrıca iç hacminin küçük olması dereceli sıyırma işlemi için ideal bir
durumdur.(Şekil-15).
HPLC cihazlarında pnömatik pompalar da kullanılabilir.
Bunlardan en basitinde hareketli faz, sıkıştırılmış hava ile basınçlandırılan
bir kabın içindeki portatif bir rezervuarda bulunur. Bunlar basittir, ucuzdur
ve darbesiz akım verirler; kapasiteleri ve çıkış basınçları sınırlıdır,
çözgenin viskozitesine göre akış hızı değişir. Bunlar dereceli sıyırma işlemi
için uygun değildir.
Pompalarla yüksek basınçlara çıkılmasının herhangi bir
tehlike yaratmayacağını belirtmek gerekir, çünkü sıvılar fazla sıkıştırılamazlar.
Bu bakımdan sistemin bir parçasında meydana gelebilecek kopma veya açılma
sadece çözgen sızıntısına yol açar.
Şekil-15: Bir pistonlu pompanın şematik görünümü
Ön Kolonlar: Bazı
HPLC cihazlarında çok bilinen ön kolonlar vardır. Ön kolonlardaki dolgu maddesi
analitik kolondaki dolgu maddesi ile kimyasal yapı bakımından aynidir, fakat
tanecik boyutları daha büyüktür. Böylece ön kolon boyunca olan basınç düşmesi,
sistemin geri kalan kısmındakine kıyasla ihmal edilebilir bir düzeydedir. Ön
kolonun amacı, çözgendeki safsızlıkları tutarak analitik kolonun kirlenmesini
önlemektir. Ayrıca ön kolon hareketli fazı sıvı ile doyurarak sabit fazı
oluşturur; böyle bir durumda analitik kolondaki dolgu maddesinden sabit fazın
sıyrılması işlemine gerek olmaz.
Örnek İnjeksiyon
Sistemleri: HPLC'de en çok döner örnek valf sistemi (Şekil-16a) ve kızak
valfler kullanılır (Şekil-16b).. Kızak, Kel-F'den üretilmiştir ve iki tetrafluoroetilen
parçası arasındaki düzlemde hareket eder konumdadır. Örnek valfe bir şırınga
ile çekilir, sonra kızak soldan sağa doğru hareket ederek örneğin solvent akımı
içine girmesini sağlar. Valfler 2-100 mikrolitre arasında örnek taşıyabilirler.
Örnek injeksiyonu bir şırıngayla da yapılabilir. İnjektör İgnesi silikon, neopren
veya teflondan yapılmış bir conta (septum)'ya batırılarak sisteme verilir; injektör
çekildiğinde conta kendi kendini kapatır.
Şekil-16:
HPLC, (a) döner örnek valfi, (b) kızak örnek valfi
Kolonlar: HPLC
kolonları kalın kenarlı cam tüpten veya hassas-delikli paslanmaz çelik borudan
yapılır. Cam tüp kolonlar 600 psi altındaki basınçlarda kullanılabilir. Kolon
uzunlukları çoğunlukla 15-150 cm, iç çapı 2-3 mm kadardır. 1 m veya daha uzun
kolonlar, kısa kolonları ucuca bağlıyarak hazırlanabilir. Kolonlar sarılmış
halde kullanılır; bu durumda kolon veriminde biraz düşme gözlenir.
HPLC kolonlarında en fazla kullanılan dolgu maddesi ince
silika jel'dir. Alumina ve Celite (diyatome toprağı)de çok kullanılan
maddelerdir. Dolgu maddelerin tanecik büyüklüklerinin 5-10 mikrometre
aralığında olması istenir.
İkinci bir tip dolgu maddesi zarlı (pellicular)
taneciklerdir; bunlar 40 mikrometre kadar çaptaki cam taneciklerinin, 1-3 mm kalınlıkta silika jel, alumina veya bir
iyon değiştirici reçine gibi poröz bir madde ile kaplanarak hazırlanır. Böyle
bir ince tabaka fazlar arasındaki dengenin hızla kurulmasını sağlar; böylece
kolon verimi yükselir. Zarlı dolgu maddeli kolonlara sınırlı miktarlarda örnek
verilebilir; bu miktar pöröz maddenin ancak onda biri kadar olabilir.
Şekil-17:
Dolgu maddesi tanecik büyüklüğünün kolon tepsi yüksekliği ve dedektör
responsuyla ilişkisi
Sıcaklık Kontrolü: Sıvı
kromatogra-filerin çoğu oda sıcaklığında ve termostatsız olarak çalıştırılır.
Sıcaklık hassas olarak izlenecekse su ceketli kolonlar kullanılır.
Dedektörler: HPLC'de,
gaz kromatog-rafide olduğu gibi çok hassas dedektör sistemlerine gereksinim
olmaz. Bu nedenle örneğe bağlı olarak çeşitli dedektörler kullanılabilir.
Tablo-3'de çok kullanılan dedektörler ve özellikleri verilmiştir.
Ultraviole ve Görünür Iışık Dedek-törler: En çok
kullanılan dedektörler ultraviyole veya görünür ışın absorb-siyonuna dayanan
dedektörlerdir. Fotometreler ve spektrofotometreler ticari cihazlardır.
Fotometrelerde bir civa kaynaklan alınan 254 ve 280 nm bandları kullanılır; bu
dalga boylarında pek çok organik fonksiyonel grup absorbsiyon yapar.
Spektrofotometrik dedektörler fotometrelerden daha elverişlidir, çünkü bunlarda
örnekteki maddelerin absorbsiyon yapacağı dalga boylarını seçme olanağı vardır.
Fotometrik dedektörlerde cihazın dalga boyu aralığında, örnekteki maddelerin
ışığı absorblaması, fakat çözgenin herhangi bir absorbsiyona neden olmaması
gerekir. Şekil-18'de ultraviyole fotometrik bir dedektörün şematik diyagramı
verilmiştir.
Tablo-3: Sıvı
Kromatografisi Dedektörlerinin Özellikileri
Dedektör
|
Tipi
|
Maks. hassasiyet (g/ml)
|
Akış hızına hassasiyet
|
Sıcaklığa hassasiyet
|
UV absorbsiyon
|
S
|
5
x 10-10
|
yok
|
düşük
|
IR absorbsiyon
|
S
|
10-6
|
yok
|
düşük
|
Fluorometre
|
S
|
10-10
|
yok
|
düşük
|
Refraktif indeks
|
G
|
5
x 10-7
|
yok
|
± 10-4 0C
|
Kondüktometre
|
S
|
10-8
|
var
|
± 1 0C
|
Hareketli tel
|
G
|
10-8
|
var
|
yok
|
Kütle spektrometresi
|
S
|
10-10
|
yok
|
yok
|
Polarograf i
|
S
|
10-10
|
var
|
± 1 0C
|
Radyoaktivite
|
S
|
yok
|
yok
|
S: seçici, G: genel
Şekil-18: HPLC ultraviyole dedektörler
İndeks Dedektörler: Refraktif indeks bir bulk özelliğidir,
dolayısıyla refraktif indeks dedektörünün algılaması hareketli fazdaki tüm
komponentlerin toplam refraktif indeksine dayanır.
Refraktif indeks dedektörü en az hassas sıvı kromatografisi
dedektörüdür; çevre sıcaklığı, basınç, akış hızı değiştiğinde dedektörün
algılaması da değişir. Çeşitli dezavantajlarına rağmen, refraktif indeks
dedektörleri, noniyonikler, UV bölgede absorbsiyon yapamayan maddeler ve
flüoresans olmayan bileşikler için çok uygun dedektörlerdir. Refraktif indeks
dedektörleri çeşitlidir; diferansiyel refraktif indeks, Fresnel metodu,
Christiansen etki, interferometre, termal lens, dielektrik sabiti dedektörler
gibi.
Şekil-19’da bir diferansiyel refraktif indeks dedektörünün
şematik diyagramı verilmiştir. Burada çözgen ve analit çözeltileri bir cam
levha ile birbirinden ayrılmıştır. Cam levha, iki çözeltinin refraktif
indeksleri birbirinden farklı olduğunda gelen ışının sapmasını sağlayacak bir
açı ile yerleştirilmiştir. Bir ışık demeti optik maskeden geçerek hücre
bölmesine gelir. Mercekler demeti yönlendirerek örnek ve referans hücrelerden
geçmesini ve düz aynaya gelmesini sağlarlar. Ayna demeti yansıtarak tekrar
örnek ve referans hücrelerine gönderir. Mercekten geçen demet bir fotosel
üzerine odaklanır. Demetin yerini şiddeti değil, açısal sapması belirler;
sapma, iki hücredeki maddeler arasındaki refraktif indeks farkının bir
sonucudur. Fotoelektrik hücrede demetin odak konumu (yeri) değiştiğinde çıkış
da değişir ve fark sinyal elektronik olarak modifiye edilerek örnek
hücresindeki madde konsantrasyonuyla orantılı bir sinyal şekline dönüştürülür.
Şekil-19: Refraktif indeks dedektörü (sapma
açısına göre)
Transport Dedektör: Tansport dedektör metal zincir,
tel veya disk gibi bir taşıyıcıdır. Sürekli olarak kolon akımından geçer,
örneğin bulunduğu hareketli fazdan örneği ekstrakt eder ve yüzeyinde ince bir
film tabakası halinde biriktirir; film üzerinde kalan hareketli faz
buharlaştırılarak uzaklaştırılır. Bu işlemden sonra taşıyıcı, üzerinde biriken
maddenin saptanması için uygun bir algılama sistemiyle taranır. Bu amaçla,
örneğin, piroliz ürünlerinin saptanması istendiğinde alev iyonizasyon dedektörü
(FID) kullanılır; bunun için taşıyıcı ısıtılır, örnekteki piroliz ürünleri
açığa çıkar ve ürünler çoğunlukla karbon içerdiğinden FID ile algılanır.
Hareketli fazda uçucu olmayan maddeler bulunması halinde
doğru sonuç vermez, ayrıca kullanılan solventin uçucu ve çok saf olması
gerekir.
Şekil-20’de, transport dedektörlere bir örnek olarak
hareketli tel (moving wire) dedektörün şematik diyagramı verilmiştir. Bu tip
bir dedektörde, sürekli hareket eden bir tel halka ile sıyırıcının bir kısmı
bir alev iyonizasyon dedektörüne taşınır. Tel önce sıyırıcıdan geçer, onu bir
fırına taşır ve burada sıyırıcının çözgeni buharlaşır. Buradan azot atmosferi
altında tutulan piroliz fırınına gelen
örnek piroliz olur; piroliz ürünleri azot gazıyla taşınarak alev iyonizasyon
dedektörü (FID) içindeki merkez tüpe taşınır ve bileşenler iyonizasyon
dedektörü tarafından algılanır. FID, hareketli fazdaki solventten etkilenmeyen
bir dedektördür.
Şekil-20: Pye Unicam hareketli tel dedektörü
Elektrokimyasal Dedektör: Elektrokimyasal dedektör
uygun elektrotların bulunduğu bir hücrede analitin oksitlenme/indirgenme
reaksiyonları sonucunda oluşan akımın ölçülmesi esasına göre çalışır. Doğan
akımın seviyesi doğrudan analit konsantrasyonuyla orantılı olduğundan bu tip
dedektörler kantitatif tayine olanak verir. Elektrokimyasal dedektölerin
uygulama alanı fazla geniş değildir; fakat hassasiyetinin yüksek olması
nedeniye özellikle doğal ürünler ve yiyecek maddeleri incelmelerinde kullanılır.
Oksijen, metal kirlilikleri ve halojenler ölçmelerde önemli hatalara neden
olurlar.
Elektrokimyasal dedektörlerde üç elektrot bulunur;
oksitlenme veya indirgennme reaksiyonunun olduğu iş elektrodu, yardımcı
elektrot ve referans elektrot.
Referans elektrot hareketli fazın taban iletkenliğinde
olabilecek değişiklikleri dengeler. Eektrotlar çeşitli geometrik şekillerde
yerleştirilebilir; ince tabaka hücrelerde en çok kullanılan yerleşimler Şekil-21(b)
ve (c)’de görüldüğü gibidir.
Şekil-21:
(a) Bir elektrokimyasal dedektör, (b), (c) farklı elektrod konfigürasyonları
Kütle spektroskopisi de hassas bir özel dedektör olarak
kullanılmaktadır. Ticari bir cihazda sıyırıcıyı iyon kaynağına taşıyan bir
paslanmaz çelik veya poliimid kayış vardır. Kaynağa ulaşmadan önce kayış bir
infrared buharlaştırıcının altından geçerek sıyırıcıdaki solventin büyük bir
kısmı buharlaşır, sonra iki farklı vakum odasından geçen örnek kütle
spektrofotometresine girer. Burada örnek, iyon odacığı içine püskürtülerek
buharlaştırılır. Tayin sınırları 0.2-1 ng gibi çok düşük değerler arasındadır.
Kromatografideki ilk uygulamaların tamamı adsorbsiyon
esasına dayanıyordu, burada sabit faz çok ince bir katı maddenin yüzeyidir.
Böyle bir dolgu maddesinde madde ve sıyırıcı solvent katı yüzeyi üzerinde yarış
halindedirler ve adsorbsiyon kuvvetlerin etkisi altındadırlar. Nötral organik
bileşiklerin ayrılmasında en çok kullanılan yöntem HPLC yöntemi ile sıvı-katı
kromatografisidir. Bir maddenin bir çözgen ve adsorblayıcı bir katı madde
arasındaki en ideal dağılımı, Şekil-1"deki A eğrisi adsorbsiyon izotermi
ile tanımlanır. Bu eğri düşük konsantrasyonlarda bir doğruya yakındır; bu durum
sıyırma işleminin doğrusal olduğunu ve pik bozulmasının da en düşük düzeyde
bulunduğunu gösterir.
Sabit ve Hareketli
Fazlar: Sıvı-katı kromatografisinde en çok kullanılan adsorblayıcı silika
jel ve Aluminadır. Dolgu maddelerinin tanecik büyüklükleri çok çeşitli
olabilir; HPLC’de kullanılan tipik silika jel dolgu maddesinin tanecik
büyüklüğü 10 mm dir ve malzemenin % 80'
i 8-12 mm aralığına girer.
Sıvı-katı kromatografisinde başarı, hareketli fazın seçimine
bağlıdır; solvent değiştirilerek maddelerin kapasite faktörü (k’), ideal
değerler olan 1-10 aralığına girecek şekilde değiştirilebilir. Bir solventin k’
değerine etkisi, onun sıyırma gücü (e0)
ne bağlıdır, bu ise bazı referans solventlere karşı relatif olarak ölçülebilir.
Örneğin X maddesi için,
yazılabilir. Burada (KX)1 ve (KX)2,
(1) ve (2) çözgenleri kullanıldığında X maddesinin katı adsorbent üzerindeki
dağılma katsayılarıdır. AX maddenin molekül büyüklüğü, e10 ve e20 (1) ve (2)
solventlerinin sıyırma kuvvetleridir. Tablo-4'de alumina adsorbent
kullanıldığında çeşitli çözgenlerin n-pentana göre sıyırma kuvvetleri
verilmiştir. Silika jel'ın e0
değerleri, alumina için olan değerlerin 0.77 sine eşittir. Sıyırma gücü yüksek
olan bir çözgen düşük olana kıyasla adsorblanan tanecikleri daha hızlı sıyırır.
Adsorbsiyon kromatografisinde çoğunlukla kademeli sıyırma
yapılır. Bunda, sıyırma gücü düşük bir çözgenle kolaylıkla sıyrılabilen
maddeler çekilir. Sonra sıyırma gücü yüksek bir çözgen ilave edilerek daha sıkı
bağlı maddeler alınır.
Tablo-4: Alumina
Adsorbenti ile Bazı Solventlerin Sıyırma Gücü
Solvent
|
Sıyırma gücü, e0
|
Solvent
|
Sıyırma gücü, e0
|
Fluoroalkanlar
|
-0.25
|
Kloroform
|
0.40
|
n-Pentan
|
0.00
|
Metiletil
keton
|
0.51
|
Petrol
eteri
|
0.01
|
Aseton
|
0.56
|
Sikloheksan
|
0.04
|
Dimetilamin
|
0.63
|
Karbon
tetraklorür
|
0.18
|
Pridin
|
0.71
|
n-Propil
klorür
|
0.30
|
n-Propanol
|
0.82
|
Benzen
|
0.32
|
Metanol
|
0.95
|
Uygulamalar: Bileşiklerin
adsorblanma eğilimleri birbirinden büyük farklılıklar gösterir ve bu özellik de
adsorbsiyon kromatografisinin temelini oluşturur. Örneğin, bir organik
molekülün adsorbsiyon özellikleri ile hidroksil gruplarının sayısı arasında
pozitif bir ilişki olduğu bilinir. Benzer bir ilişki çift bağlar için de söz
konusudur. Bazı fonksiyonlu gruplar içeren bileşikler diğerinden daha sıkı
tutulurlar. Adsorblama eğilimi aşağıdaki sıraya göre azalır: asid > alkol
> karbonil > ester > hidrokarbon. Adsorbsiyon sırasının saptanmasında
adsorbentin yapısı da önemlidir.
Adsorbent ve solvent seçimi deneme-yanılma yöntemiyle
yapılır. Şekil-22'de HPLC ile yapılan tipik bir sıvı-katı ayırması
görülmektedir.
Şekil-22: Adrenal steorid-kortizonların sıvı-katı kromatografisi
Dağılma veya sıvı-sıvı kromatografisi Martin ve Synge'nin
Nobel ödülünü kazandıkları çalışmaları ile başlamıştır (1941). Bu çalışmada
tepsi yüksekliği 0.002 cm kadar küçük olan özel bir kolon hazırlanabileceği
gösterilmiştir. Bu durumda 10 cm'lik bir kolonda 5000 teorik tepsi
bulunabilecektir. Hatta daha kısa kolonlarda bile yüksek ayırma gücüne erişilebilecektir.
Katı Destek
Maddeleri: Dağılma kromatografisinde en çok kullanılan katı destek
maddeleri silisik asit veya sika jel'dir. Bu madde suyu kuvvetle adsorblar; bu
nedenle sabit faz suludur. Bazı uygulamalarda su filmine bir tampon veya
kuvvetli bir asit (veya bir baz) ilavesi ayırmayı kuvvetlendirebilir. Alifatik
alkoller, glikoller ve nitrometan gibi polar çözgenler de tek başlarına veya su
ile karışım halinde silika jel'e emdirilerek sabit faz olarak kullanılır.
Destek olarak kullanılan diğer maddeler arasında alumina, diyatome toprağı,
nişasta, selüloz ve çok ince (toz) cam sayılabilir; bu katılar su ve çeşitli
organik sıvılarla kaplanarak kullanılır.
Hareketli faz saf bir çözgen veya çözgenler karışımıdır;
polaritesi sabit faz sıvısından, sabit faz ile karışmayacak derecede farklı
olmalıdır. Sabit faza emdirilen çözgen karışımı çoğunlukla, polariteleri yüksek
iki çözgendir; "ters-faz" kromatografisinde ise sabit faz polar
olmayan bir çözgen, hareketli faz da polar bir çözgendir. Sabit ve hareketli
sıvı çiftlerinin seçimi deneyerek yapılır. Daha önce değinildiği gibi ayırmanın
verimli olabilmesi için kademeli sıyırma uygulanır.
Destek Maddesi ile
Bağlanmış Dolgu Maddeleri: HPLC’de çok kullanılan bir dolgu maddesi tipi de
üzerinde kimyasal olarak bağlanmış organik bir grup bulunan saf silika jel
tanecikleridir. Örneğin, Klorooktadesil silan'ın silika jel yüzeyi üzerinde OH
grupları ile reaksiyonundan bir hidrokarbon yüzey oluşur.
Burada R oktodesil grubunu ve daire içindeki Si'de jel
taneciği üzerindeki pek çok SiOH gruplarından birini gösterir. Silika jel'e
bağlanabilen başka gruplar da vardır; alifatik aminler, eterler, nitratlar ve
aromatik hidrokarbonlar gibi.
Kimyasal olarak bağlanmış silika, yüzey adsorbsiyonun olduğu
katı yüzey ile sıvı-sıvı dengesinin oluştuğu akıcı olmayan sıvı arasında
bulunan bir ara kademedir.
Uygulama: Dağılma
kromatografisi ile birbirine çok benzer maddeler ayrılabilir. Tipik örnekler
arasında bir proteinin hidrolizinden elde edilen çok sayıdaki amino asitlerin, benzer
alifatik alkollerin ve şeker türevlerinin analizleri verilebilir. Şekil-23'de
amino asitlerin ayrılması görülmektedir. Burada destek maddesi kimyasal olarak
bağlı silika jeldir.
Kimyasal olarak bağlı yüzeylerin, normal katı-destekli
sıvılara göre önemli derecelerde avantajları vardır.
Şekil-23:
Amino asitlerin dağılma kromatografisi ile
birbirinden ayrılması
İyon-değiştirici reçineler kolon kromatografisinde çok
kullanılan dolgu maddeleridir. Diğer kolon yöntemlerinin tersine burada solvent
su, ayrılacak maddeler de iyonlardır. Bu nedenle iyon-değiştirici kromatografi
inorganik kimyasal analizlerde çok kullanılan bir yöntemdir. Ayni zamanda amino
asitlerin ve diğer organik asidlerin ve bazların ayrılmasında da uygundur.
İyon değiştirme, bir çözelti ve bu çözelti ile ilişki
halinde olan fakat çözünmeyen bir katı madde arasındaki, ayni işaretli
iyonların birbiri ile yer değiştirmesi olayıdır. Nötral veya sentetik pek çok
madde iyon değiştirici gibi davranır. Klay ve zeolitlerin iyon-değiştirme
özellikleri uzun zamandan beri bilinmekte ve bunlar yüzyılı aşkın bir süredir
bu amaçla kullanılmaktadır. Sentetik iyon-değiştirici reçineler ilk defa
1935'de yapıldı ve su sertliğinin giderilmesi, suyun deiyonizasyonu ve iyon
ayırma işlemlerinde geniş bir uygulama alanına yayıldı.
Sentetik iyon-değiştirici reçineler, her molekülünde çok
sayıda iyonik fonksiyonel gruplar içeren yüksek molekül ağırlıklı polimerik
maddelerdir. Katyon değiştirici reçinelerden sülfonik asit grupları (RSO3-H+)
içeren kuvvetli asit reçineleri, karboksilik asit grupları (RCOOH) içeren zayıf
asit reçinelerden daha çok kullanılır. Anyon-değiştirici reçinelerde bazik
fonksiyonel gruplar bulunur; bunlarda polimer molekülüne bağlanmış, çoğunlukla,
amin grupları vardır. Kuvvetli baz değiştiricilerde kuvaterner aminler [RN(CH)+3OH-],
zayıf baz olanlarında ise sekonder veya tersiyer aminler bulunur.
Bir katyon-değiştirme reaksiyonu aşağıdaki denklemle
anlatılabilir.
Burada M+x bir katyonu, R reçine molekülünün
kalan kısmını gösterir. Anyon değiştiricinin reaksiyonu da benzer bir şekilde
yazılabilir (A-x anyondur).
İyon-değiştirici reçineler sıyırma kromatografisinde başarı
ile kullanılmaktadır. Örneğin, Beukenkamp ve Reiman, sulfonik asit reçinesi
(asidik hali) ile doldurulmuş bir kolonla Na+ ve K+
iyonlarını ayırabilmişlerdir. Örnek kolonun tepesinden konulduğunda her iki
alkali iyon için de aşağıdaki reaksiyon olur.
Burada B+, Na+ veya K+
iyonlarını gösterir. İyon değiştirme reaksiyonunun denge sabiti,
şekilde yazılır. Burada [RB] ve [RH] katı reçine fazındaki
alkali ve hidrojen iyonlarının konsantrasyonlarıdır (veya yaklaşık
aktiviteleri). Denklem(2) aşağıdaki,
şekilde yazılabilir. KD, dağılma katsayısıdır.
Sıyırmanın hidroklorik asit ile yapıldığı koşullarda KD yaklaşık
olarak sabit kalır, çünkü sıyırıcının hidrojen iyonu konsantrasyonu, potasyum
ve sodyum iyonlarına göre çok büyüktür. Reçinenin değiştirme yapabileceği
uçları da örnekdeki alkali metal iyonları sayısından çok fazladır. Böylece [H+] ve [RH]
ın toplam konsantrasyonları, dengenin kaymasından etkilenmezler (denklem 1).
Buna göre [RH] ve [H+] ın [RB] ve [B+] ye göre büyük olduğu
koşullarda denklem(3), denklem(1) gibi kullanılabilir ve genel kromatografi
teorisi, sabit fazın iyon değiştirici bir reçine olduğu halde de uygulanabilir.
Denklem(3)'deki KD değeri reçinenin diğer iyonla
kıyaslandığında B+ iyonuna karşı ilgisini gösterir. KD
büyükse B+ iyonunun katı fazda kalma eğilimi artar, tersine KD
nin küçük olması bu eğilimi azaltır (buradaki diğer iyon H+ 'dir). H+
gibi çok bilinen bir referans iyon seçilerek bilinen bir reçinede değişik
iyonların dağılım oranları kıyaslanabilir. Böyle bir inceleme çok değerlikli
iyonların tek değerlikli iyonlara göre daha sıkı tutulduğunu göstermiştir. Aynı
değerlikli iyonlar arasında yapılan incelemelerde ise hidratlanmış iyonun, bazı
özellikleri yanında, büyüklüğünün de etkin olduğu gözlenmiştir. Tipik bir
sülfolanmış katyon değiştirici reçinenin KD değerleri aşağıdaki
sıraya göre azalır: Cs+ > Rb+ > K+ >
NH4+ > Na+ > H+ > Li+.
İki değerlikli katyonlar için de şöyle bir sıra yazılabilir: Ba+2
> Pb+2 > Sr+2 > Ca+2 > Cd+2
> Cu+2 > Zn+2 > Mg+2.
KD değerleri yakın olan iyonların birbirinden
ayrılması için, adsorbsiyon ve dağılma kromatografilerinde uygulanana benzer
yöntemler kullanılır. Örneğin, Şekil-24’de alkali metal iyonlarının sülfonik
asitli katyon değiştirici bir reçinede (zar dolgu) ayrılmasını gösteren HPLC
kromatogramı verilmiştir; orijinal çözelti her katyon için 0.01 M dir. Şekil-24(b)'de
kazan kondensat suyundaki anyonların anyon-değiştirici bir reçinede ayrılması
görülmektedir; burada iyon konsantrasyonları ppm seviyelerdedir. Her iki
ayırmada da elde edilen pik yükseklikleri uygun standartlardan alınan pik
yükseklikleri ile kıyaslanarak kantitatif bilgiler alınabilir. Tayinlerde
iletkenlik dedektörleri kullanılmıştır. Sıyırıcı iyonların analit içinde kalmaması
için analitik kolondan sonra bir sıyırıcı kolon bulundurulur. Katyonların ayrılmasında
sıyırıcı bir anyon-değiştirici reçinenin hidroksiti ile doldurulur. Bu reçine
HCL sıyırıcı çözeltiyi, katyonları etkilemeden adsorblayabilir. Sıyırıcı
kolondaki reaksiyon aşağıdaki gibidir.
Anyonların ayrılmasındaki reaksiyon da,
şeklindedir. Burada H 2CO3 'ın çözgenin iletkenliğine önemli bir tesiri
yoktur.
İyon-değiştirici kromatografisi en çok amino asitlerin
analizinde kullanılır. Örneğin, Şekil-25’de, her birinden 1.0 x 10-8
mol bulunan 17 amino asit karışımının kromatogramı verilmiştir. Ayırma zamanı
sadece 42 dakikadır. Değişik pH larda tamponlar kullanılarak kademeli sıyırma
uygulanmıştır.
Jel kromatografisi ayırmayı örnekteki maddelerin molekül büyüklüklerine
göre yapan bir kromatografi tekniğidir. Bu tekniğe çeşitli adlar verilmiştir;
jel geçirme (gel permeation) kromatografisi, çıkarma (exclusion) kromatografisi
ve moleküler-elek (molecular sieve) kromatografisi gibi.
Jel kromatografisi, bir kolonda, sıyırma yöntemiyle yapılır.
Burada maddenin çıkma derecesi, madde molekülleri veya iyonlarının çözelti
fazına olan giriciliklerine bağlıdır; çözelti, porozitesi yüksek jel yapılı
dolgu maddesi içinde tutulmuştur. Jelin gözeneklerinden daha büyük olan
moleküller veya iyonların tamamı kolondan çıkarlar, daha küçüklerinin çıkışı
ise küçüklüğünün derecesine, şekline ve bazan da jel tarafından adsorblanma
eğilimlerine göre değişir.
Şekil-24:
İnorganik iyonların iyon-değiştirici kromatografisi ile ayrılması; kolon: 250 x
9 mm, sülfonik asitli reçine dolgulu, sıyırıcı: 0.01 N HCl, örnek miktarı: o.1
ml; (b) kolon: 500 x 2.8 mm, sıyırıcı: glikolat + Cl- için 0.0015 M
NaHCO3, diğer anyonlar için: 0.003 M NaHCO3 + 0.0024 M Na2CO3,
örnek miktarı: 100 mL
Şekil-25:
Amino asitlerin bir iyon-değiştirici kolonda ayılması; dolgu maddesi: tanecik
büyüklüğü 8 mm olan katyon değiştirici reçine, basınç =
2700 psi
Kolon Dolgusu: Jel
kromatografisindeki sabit faz, su adsorbsiyonu (bazan başka çözgenler) fazla
olan ve şişebilen, küçük tanecikler halinde, poröz bir polimerik maddedir.
Çalışmaya hazırlanmış dolgu maddesinde polimer ağı içinde tutulmuş büyük
miktarda çözgen vardır. <158>işen gözeneklerin ortalama büyüklükleri
adsorplanan çözgenin miktarına bağlıdır; bu ise, polimer moleküllerindeki
çapraz bağ miktarı ile saptanır.
Çok kullanılan bir polimer, polisakkarid dekstran'ın
epiklorhidrin ile çaprazbağlanmasıyla hazırlanır. Epiklorhidrin miktarının
değiştirilmesiyle gözenek büyüklükleri farklı bir seri polimer elde edilebilir.
Bu jeller Sephadex ticari adı altında satılmaktadır. Tablo-5'de Sephadex
jellerinden bazılarının özellikleri verilmiştir. Metilen birakrilamid ile
çapraz-bağlanmış poliakrilamid'den hazırlanmış reçineler de diğer bir grup
ticari reçinelerdir.
Tablo-5: Ticari
Sephadex Jellerin Özellileri
Jel
tanımı
|
Hacim
ilişkisi, ml/g, orijinal jel(a)
|
Yaklaşık
çıkma sınırı, mol.ağ.
|
||
Vg
|
Vi
|
V0
|
||
G-10
|
0.6
|
1.0
|
0.9
|
700
|
G-15
|
0.6
|
1.5
|
0.9
|
1500
|
G-25
|
0.5
|
2.5
|
2
|
5000
|
G-50
|
1
|
5
|
4
|
10000
|
G-75
|
1
|
7
|
5
|
50000
|
G-100
|
1
|
10
|
6
|
100000
|
G-150
|
1
|
15
|
8
|
15000
|
G-200
|
1
|
20
|
9
|
200000
|
(a) Vg
katı jel matriksin kapladıı hacim, Vi: gözeneklerde tutulan
solvent hacmi,
V0: jel tanecikleri arasındaki sıvı hacmi
V0: jel tanecikleri arasındaki sıvı hacmi
Jel Kromatografisinin
Teorisi: Suyla veya bir çözgenle şişirilmiş bir jel ile doldurulan kolonun
toplam hacmi aşağıdaki ifade ile verilir.
Vg jelin katı matriksinin kapladığı alan, Vi
jel gözenekleri içinde tutulan çözgen hacmi, V0 jel tanecikleri
dışında kalan hacimdir. Bir karışma veya difüzyon olmadığı vasayıldığında, V0
aynı zamanda, maddeleri jel gözenekleri içine taşıyan solvent miktarını
gösterir. Gerçekte ise bir miktar karışma ve difüzyon olayı vardır ve bu
nedenle de Gaussian-şekilli eğride yer alan maddeler V0 ‘da bir
maksimum verirler. Jel gözenekleri içine kolaylıkla girebilecek küçüklükteki
moleküller için bu maksimum kolonun sonunda ve Vi + V0
değerinde meydana gelir. Vi, V0 ve Vg
büyüklükleri, çoğunlukla birbirine yakındır; bu da, bir jel kolonu ile bir
örnekteki büyük moleküllerin küçük moleküllerden ayrılması işleminde kullanılan
yıkama sıvısının çok az olduğunu gösterir.
Büyüklükleri orta derecelerde olan moleküller gözeneklerde
tutulan çözgenin bir kısmına girebilirler; bu fraksiyon Kd ile gösterilirse
sıyırıcı hacmi Ve için aşağıdaki eşitlik yazılabilir.
Bu denklem bir jel kolonunun tüm maddelere karşı davranışını
tanımlayabilir. Jel gözeneklerinden geçemeyecek kadar büyük moleküller için Kd
= 0 ve Ve = V0 dır;
gözeneklere girebilen maddeler için ise Kd = 1 ve Ve = V0 +Vi
dir. Denklem(4) ün yazılmasında madde molekülleri ve jel yüzeyleri arasında
adsobsiyon gibi etkileşimlerin olmadığı varsayılmıştır. Bu tür etkileşimler
varsa, gözeneklerde tutulan madde miktarı artar; gözeneklere kolaylıkla
girebilen maddeler için Kd > 1 olur. Tablo-6’da dekstrant-tipli
jeller için deneysel saptanan Kd değerleri verilmiştir.
Tablo-6: Sephadex
Jellerin Kd Değerleri
Kd
|
|||||
Madde
|
Yakla-şık
mol ağ.
|
Sepha-dex
G-25
|
Sepha-dex
G-75
|
Sepha-dex
G-100
|
Sepha-dex
G-200
|
Amonyum
sülfat
|
132
|
0.9
|
-
|
-
|
-
|
Potasyum
klorür
|
74
|
1.0
|
-
|
-
|
-
|
Titiptofan
|
204
|
2.2
|
1.2
|
-
|
-
|
Glisin
|
76
|
0.9
|
1.0
|
-
|
-
|
Ribonükleas
|
13000
|
0
|
0.4
|
-
|
-
|
Tripsin
|
24000
|
0
|
0.3
|
0.5
|
0.7
|
Serum
albumin
|
75000
|
0
|
0
|
0.2
|
0.4
|
Fibrinojen
|
330000
|
0
|
0
|
0.0
|
0.0
|
Jel Kromatografisi
Uygulamaları: Sephadex G-25 ve G-50 gibi, çok sıkı çapraz bağlı ve küçük
gözenekli jeller tuz giderme işlemlerinde, veya yüksek molekül ağırlıklı
doğal-maddelerden düşük molekül ağırlıklı molekülleri ayırmada kullanılır.
Tablo-6'daki değerlerden de anlaşıldığı gibi G-25 jeli tuzları ve proteinlerden
amino asitleri kolaylıkla ayırabilir. Burada, düşük molekül ağırlıklı
moleküllerin Kd değerleri 1'e yaklaşırken, Kd değeri
sıfır olan proteinler jelden tümüyle çıkarılırlar. Sonuçta, büyük hacimlerde
(yatak toplam hacminin % 20-30'u) örneklerle çalışılması halinde bile iyi bir
ayrılma elde edilir. Böyle bir ayırma, bir sellofan membrandan yapılan diyalize
benzer, fakat daha hızlı ve daha uygun bir ayırma yöntemidir.
Sephadex G-25 ve G-50 jelleri, Tablo-6'da verilen proteinler
ile düşük molekül ağırlıklı maddeler arasında bulunan büyüklüklerdeki
peptidlerin ayrılmasında da uygundur. Bu bileşiklerin K d değerleri 0'dan büyük 1'den küçüktür. Tablo-6'daki
çok gözenekli jeller, proteinler, nükleik asitler ve polisakkaridler gibi
makromoleküllerin ayrılması ve saflaştırılmasında kullanılırlar; Sephadex 75,
tripsin, pepsin ve sytokrom C'nin, serum, albumin, hemaglobin ve fibrinofen
gibi yüksek molekül ağırlıklı proteinlerden ayrılmasında kullanılabilir.
Jel-geçirme kromatografisi, polimer kimyacıları ve
biyokimyacılar tarafından büyük moleküllerin molekül ağırlıklarını saptamada
kullanılmaktadır. Burada, bilinmeyen maddenin sıyrılan hacmi, ayni kimyasal
özelliklerdeki bir seri standart maddenin sıyrılan hacimleri ile kıyaslanır.
Yüksek-performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ve gaz-sıvı
kromatografisi arasındaki kıyaslama Tablo-7'de verilmiştir. Her ikisinin de
uygulanabildiği durumlarda, gaz, sıvı kromatografisi tercih edilir, çünkü
gaz-sıvı kromatografisi cihazı çok basittir ve sonuçlar daha hızlı alınır.
Uçucu olmayan maddeler (inorganik tuzlar da dahil) ve sıcaklıkla bozunabilen
kararsız bileşikler gaz-sıvı kromatografisi ile analiz edilemezler, ancak HPLC
yöntemi uygulanabilir. Bu iki kromatografik yöntem, çoğunlukla, birbirlerini
tamamlarlar.
Tablo-7:
Yüksek-Performans Sıvı ve Gaz-Sıvı
Kromatografilerinin Kıyaslaması
Kromatografilerinin Kıyaslaması
Her
iki yöntemin ortak özellikleri
|
Verimli,
seçiciliği yüksek, kullanım alanı geniştir
|
Az
miktarda örnekle çalışılabilir
|
|
Örnek
bozunmadan kalır
|
|
Kantitatif
analizlerde kullanılabilir
|
|
Yüksek-performans
sıvı kromatografisinin özel avantajları
|
Uçucu
olmayan ve ısıl kararlılığı olmayan örneklere uygulanabilir
|
İnorganik
iyonların analizleri yapılabilir
|
|
Gaz-sıvı
kromatografisinin özel avantajları
|
Cihaz
basittir, ucuzdur
|
Analiz
sonuçları hızlı alınır
|
