Absorbsiyon spektroskopisi kantitatif analizlerde kimyacının
yararlandığı en önemli yöntemlerden biridir. Spektrofotometrik ve fotometrik
yöntemlerin önemli özellikleri aşağıda sıralanmıştır.
1. Geniş uygulama alanı. Daha önce
de değinildiği gibi, pek çok inorganik ve organik madde ultraviyole ve görünür
bölgede absorbsiyon yapar, bu nedenle de hassas kantitatif analiz yapılabilir.
Ayrıca absorbsiyon yapamayan pek çok madde de uygun kimyasal işlemlerle
absorbsiyon özelliği olan maddelere dönüştürülerek analiz edilebilirler.
2. Yüksek hassasiyet. Uygun molar
absorbtiviteler 10000-40000 aralığındadır, özellikle inorganik maddelerin bazı
yük-transfer komplekslerinde bu değer oldukça yüksektir; 10-4 –10-5
M konsantrasyonlarda hassas analizler yapılabilir; hatta uygun işlemlerle
konsantrasyon 10-6 M, 10-7 M'a kadar düşürülebilir.
3. Orta-yüksek seçicilik. Bir
örnekteki sadece absorblayan kısmın tayin edilebileceği bir dalga boyu bölgesi
saptanır ve çalışmalar bu bölgede yapılır. Ayrıca, absorbsiyon bandlarının üst
üste düşmesi halinde başka dalga boylarında bulunabilecek absorbsiyon bandları
ölçümünden yararlanılarak gerekli düzeltmeler yapılabilir; yani ayırma gibi bir
işleme gerek olmaz.
4. Doğru veriler. Tipik
spektrofotometrik veya fotometrik işlemlerde konsantrasyon ölçmelerindeki
relatif hata %1-3 aralığındadır. Gerekli dikkat ve titizliğin gösterilmesiyle
bu hatalar binde birkaç seviyesine kadar düşürülebilir.
5. Kolaylık ve rahatlık. Spektrofotometrik
veya fotometrik ölçmeler modern cihazlarda çok kolay ve süratle yapılabilir.
Kantitatif absorbsiyon yöntemleri,
sadece maddenin miktarını belirten sayısal değerlerin bulunmasına değil, aynı
zamanda çeşitli-kantitatif kimyasal bilgilerin elde edilmesine de olanak verir.
Absorblayıcı
Maddelere Uygulama
Tablo-2, 3, 4'de (*) pek çok
organik kromofor görülmektedir. Bu gruplardan bir veya daha fazlasını içeren
herhangi bir organik maddenin spektrofotometrik analizi yapılabilir; bu tip analizlere
literatürde pek çok örnek bulunabilir. (*Ultraviyole Ve Görünür Spektroskopi;
Absorblayıcı Maddeler).
Bazı inorganik maddeler de
absorbsiyon yapabilirler ve doğrudan tayin edilebilirler; çeşitli geçiş
metalleri bu tip maddelerdir. Ayrıca, bazı başka tip grupların da özel
absorbsiyonları vardır. Bunlar arasında nitrit, nitrat ve kromat iyonları; osmiyum
ve rutenyum tetraoksit; moleküler iyod; ve ozon sayılabilir.
Absorbsiyon Yapmayan
Maddelere Uygulama
Ultraviyole veya görünür bölgede
absorbsiyon yapmayan maddelerle reaksiyona girerek absorblayıcı ürün veren çok
sayıda madde vardır. Bu tip maddelerin kantitatif analizlerde başarılı olması
için, reaksiyonun sonunda örnek ile renkli bir madde vermesi gerekir. Bunlar,
kendileri absorblayıcı maddelerdir, örneğin, geçiş-metal iyonları gibi; ürünün
molar absorbtivitesi, reaksiyona giren her iki maddenin molar
absorbtivitesinden de daha büyüktür.
İnorganik maddelerin tayini
bilinen kompleks yapıcı maddelerle yapılır. Bunlar arasında, demir, kobalt, ve
molibden için tiyosiyanat iyonu; titanyum, vanadyum, ve krom için hidrojen
peroksit anyonu; bizmut, palladyum, ve tellur için de iyodür iyonu sayılabilir.
Bu amaçla kullanılabilen organik şelat yapıcı maddeler katyonlarla kararlı ve
renkli bileşikler verdiklerinden daha da önemli bileşiklerdir. Örneğin, demir
için o-fenantrolin, nikel için dimetilglioksim, bakır için dietilditiokarbamat,
kurşun için de difenilditiyokarbazon kullanılır.
Dalga Boyu Seçimi
Spektrofotometrik absorbans
ölçümleri konsantrasyon değişikliği ile absorbans değişikliğinin en fazla
olduğu absorbsiyon pikinin bulunduğu dalga boyunda yapılır; böylece en yüksek
hassasiyetle çalışılır. Bu bölgede absorbsiyon eğrisi oldukça düzgündür ve Beer
kanunu ile iyi bir uyum içindedir. Ayrıca cihazın dalga boyu ayarından
kaynaklanan hatalar da ölçümleri önemli derecede etkilenmez.
Absorbsiyon spektrumdan, bazı
hallerde fotometrik bir analiz için uygun filtre seçimi de yapılabilir;
spektrumdan alınabilecek bilgilerin bu konuda yetersiz olması durumunda filtre
seçimi 2.1.1. 'deki yöntemlere göre yapılır.
Absorbansı Etkileyen
Değişkenler
Bir maddenin absorbsiyon
spektrumunu etkileyen değişkenler çözücünün yapısı, çözeltinin pH'ı, sıcaklık,
yüksek elektrolit konsantrasyonu ve girişim yapıcı maddelerdir. Değişkenlerin
etkileri önceden bilinmelidir ki, absorbansın, bu değişkenlerde olabilecek
küçük farklılıklardan etkilenmeyeceği koşullarda yapılması sağlanmalıdır.
Hücrelerin
Temizlenmesi ve Kullanılması
Doğru bir spektrofotometrik
analizde iyi-kaliteli ve aynı özelliklerde hücrelere gereksinim vardır.
Hücreler, zamanla özelliğinin bozulup bozulmadığını (aşınma, çizikler oluşması
gibi) test etmek için birbirine karşı kalibre edilir. Önemli bir konu da
hücreleri yıkama ve kurutmada uygun bir teknik kullanılmasıdır. Örneğin, mercek
temizlemede kullanılabilecek kalitede bir kağıt parçası spektro saflıkta metanol
ile ıslatılır, hücrenin dış kısımları silinir ve yüzeyde kalan metanolün buharlaşması
beklenir.
Absorbsiyon ve
Konsantrasyon İlişkisinin Saptanması
Analiz koşulları saptandıktan
sonra bir seri standart çözelti kullanılarak kalibrasyon eğrisi hazırlanır.
Standartlar, örneğin konsantrasyonuna yakın değerlerde olmalıdır.
Standart Katma
(İlave) Yöntemi
En ideal durum kalibrasyon
standartlarının örnek matriksindeki hem analit hem de diğer maddelerin
konsantrasyonlarına yakın miktarlarda bileşen içermesidir; böylece, örnekteki
diğer maddelerin, ölçülen analit absorbansına etkisi en aza indirilmiş olur.
Örneğin, renkli pek çok metal iyonu komplekslerinin absorbansı ortamda sülfat
veya fosfat iyonlarının varlığında azalır; çünkü bu iyonlar metal iyonlarıyla
renksiz kompleksler oluştururlar. Böyle bir durumda elde edilen absorbans
değeri gerçek değerinden düşük olur. Sülfat veya fosfatın matriks etkisi
standartlara, bu iyonlardan örnekte bulundukları miktara yakın miktarlarda
ilavesiyle yenilir. Ancak, topraklar, mineraller, ve fabrika külleri gibi
örneklerin analizinde, örneğe benzer bileşimde standartların hazırlanması
olanaksız veya çok zordur. Bu gibi durumlarda matriks etkisini yok edebilmek
için "standart ilavesi yöntemi" uygulanır.
Standart katma birkaç şekilde
yapılabilir. Fotometrik ve spektrofotometrik çalışmalarda en çok uygulanan
yöntem, aynı miktardaki örneklere standart bir çözeltiden artan miktarlarda ilaveler
yapılmasıdır. İlavelerden sonra çözelti sabit bir hacme tamamlanır ve
absorbansları saptanır. Örnek miktarı sınırlı ise, belirli bir miktar örneğe
standart ilavesi sıra ile yapılır ve ilaveden sonra (ve orijinal örnekte) absorbans
ölçülür. Bu yöntem voltammetrik ve potansiyometrik ölçmelerde çok kullanılır.
Bir örnekten aynı Vx
hacminde analit konsantrasyonu Cx olan birkaç kısım alınsın ve hacmi
Vt olan volumetrik balonlara konulsun. Balonların her birine, Vs
hacminde Cs konsantrasyonunda analit bulunan standarttan değişik
hacimlerde ilaveler yapılsın. Sonra renk oluşturan madde konularak her çözelti
aynı hacme seyreltilsin. Beer kanunu geçerliyse çözeltilerin absorbansları
aşağıdaki eşitlikle verilir.
Şekil-1 (a): Fe+3’ün (SCN- kompleksi)
standart ilavesi yöntemiyle tayini
Doğal su örneğinden, 50.00 ml'lik
beş balonjojeye 10'ar ml konulur. 11.1 ppm Fe+3 iyonu içeren standard çözeltiden balonjojelere
sıra ile 0.00, 5.00, 10.00, 15.00 ve 20.00 ml ilave edilir, sonra kırmızı
Fe(SCN)+2 kompleksini oluşturacak kadar tiyosiyanat iyonu eklenir.
Balonlar 50 ml'ye su ile tamamlanır. Bu çözeltilerden alınarak yeşil filtreli
bir fotometrede absorbanslar ölçülür: 0.215, 0.424, 0.685, 0.826, 0.967
(ölçmelerde 0.982 cm'lik hücreler kullanılmıştır. (a) Su örneğindeki Fe+3
konsantrasyonunu; (b) eğimdeki, gerilemedeki ve Fe+3
konsantrasyonundaki standard sapmaları hesaplayın
(a) Burada Cs = 11.1
ppm, Vx = 0.00 ml, Vt = 50.00 ml dir. Şekil-1(a)'daki
eğri Beer kanununa uygunluğu gösterir. Şekildeki doğrunun denklemini (A = a + b Vs)
elde edebilmek için EK-1, 1.6.2. deki örnekte görülen işlemler yapılır; sonuçta
b = 0.03812 ve a = 0.2422 bulunur . Doğrunun
denklemi:
(b) EK-1, Denklem(26) ve (27)
eğimin ve gerilemenin standart sapmalarını verir: sr = 0.045 ve sc
=0.0029 dur. Denklem(3)'de yerine konularak sc bulunur.
ÖRNEK
Şekil-1 (b): Suda, standart ilavesi yöntemiyle nitrit
tayini
Absorblayıcı Maddeler
Karışımının Analizi
Bir çözeltinin bir dalga boyundaki
toplam absorbsiyonu, çözeltide bulunan absorblayıcı maddelerin absorbsiyonları
toplamına eşittir. Bu bağıntı, spektra birbiri üzerine düşşe bile, bir
karışımda bulunan maddelerin her birinin ayrı ayrı analiz edilebilmesine olanak
verir. Örneğin, M ve N karışımının spektrumu Şekil-2'deki gibi olsun.
Karışımdaki maddelerden sadece birine ait bir dalga boyu yoktur, bu nedenle de
M veya N yi tek bir ölçüm ile saptamak olanaksızdır. Karışımın l’ ve l"
deki iki absorbansı ile aşağıdaki eşitlikler yazılabilir.
l’ de A’ = e’M
b cM + e’N b cN
l" de A" = e"M b cM + e"N
b cN
Dört molar absorbtiviteler e’M,
e’N, e"M, ve e"N,
M ve N nin standard çözeltilerinin Beer kanununa göre çizilen eğrilerinin
eğiminden bulunabilir. Karışımın absorbansları A’ ve A", kalınlığı b olan
hücrelerle deneysel olarak saptanır. Bu verilerle yukarıdaki denklemlerden cM
ve cN hesaplanabilir. Bu yöntem sadece Beer kanununun geçerli olduğu
hallerde doğrudur. Bu tip bir analizde en yüksek doğruluğa ulaşmak için molar
absorbtivite farklarının en fazla olduğu dalga boylarında çalışılmalıdır.
İkiden fazla absorblayıcı madde
içeren karışımların analizi de, örneğin üçlü bir karışımda ilave bir test daha,
dörtlü bir karışımda ilave iki test daha olmak üzere, ilke olarak ikiden her
fazlalık için birer test ilavesiyle yapılabilir. Çok maddeli karışımlarda madde
sayısı arttıkça elde edilen verilerin doğruluğu da azalır.
Şekil-2: İki maddeli bir karışımın absorbsiyon spektrumu
ÖRNEK:
0.246 g çelik asitte çözülüp su
ile 250 ml ye seyreltilmiştir. Çözeltide Cr ve Mn tayini yapılmak isteniyor.
Örnekten 50 ml alınarak katalitik miktarda Ag+ iyonlarının bulunduğu
bir ortamda potasyum persülfat ilave ediliyor; reaksiyonda Cr, C2O7-2
ye, Mn da MnO4- iyonlarına dönüşür. Çözelti su ile 100 ml
ye tamamlanıp, 1.00 cm'lik hücrede 440 ve 545 nm'deki absorbansları
ölçüldüğünde sırasıyla 0.932 ve 0.778 değerleri bulunuyor.
Aşağıdaki veriler bilindiğine göre
çelikteki Mn ve Cr % leri ne kadardır?
440
nm'deki absorbans için,
0.932
= 369 x 1.00 x MCr + 95 x 1.00 x MMn
545 nm deki absorbans için,
0.778
= 11 x 1.00 x MCr + 2350 x 1.00 x MMn
eşitlikleri yazılabilir. Birinci
eşitlik MCr'ye göre düzenlenip ikinci eşitlikte yerine konursa MMn
değeri bulunur. Bu değer kullanılarak MCr hesaplanır.
Türev
Spektrofotometresi
Türev spektrofotometresinde spektrumun
ordinat ekseni, absorbansın veya geçirgenliğin dalga boyuna göre birinci veya
ikinci türevidir. Şekil-3'deki eğrilerden de görüldüğü gibi böyle bir spektrum
(18a), normal bir absorbsiyon spektrumuna (18b) göre spektral detayları daha
açık bir şekilde belirtilir.
Türev spektrumları iki türlü elde
edilebilir. Bunlardan birisinde, kaydedici bir spektrofotometrenin
transduserinden çıkan sinyal elektronik veya mekanik olarak DT/Dl şekline dönüştürülür ve
bu değerler dalga boyunun fonksiyonu olarak kaydedilir. İkinci yöntemde Şekil-4'de
görülen tipte bir "çift-dalga" boylu spektrofotometre kullanılır.
Böyle bir cihaz hem çift-dalga boyu sisteminde, hem de normal çift-demetli
sisteme göre çalışabilir. Çift-dalga boyu sisteminde referans hücre kullanılmaz,
örnek hücresi sıra ile her bir gratingden gelen ışın yolu üzerine konulur.
Şekil-3: Bir (a) türev eğrisinin, standart
bir geçirgenlik eğrisi (b) ile kıyaslanması
Çift-demetli sistemde ise sadece monokromatör
1 kullanılır ve ışın önce örnekten sonra referansdan geçirilir. Şekil-3'deki
gibi bir spektrum çift-dalga boylu bir cihaz ile elde edilebilir.
Monokromatörlerden birinin dalga boyu diğerinden 1-2 nm düşük bir değere
ayarlanır, sonuçlar türev olarak kaydediciye geçirilir.
Çift-dalga boylu
spektrofotometrelerle, birbirine benzer spektrumlar veren iki madde
karışımındaki maddelerden birinin kantitatif analizi de yapılabilir. Böyle bir
durumda monokromatörlerden biri iki maddenin molar absorbtivitelerinin aynı
olduğu bir dalga boyuna ayarlanır. Diğer monokromatör ise analit absorbansının
konsantrasyonla büyük değişiklik gösterdiği bir dalga boyuna ayarlanır.
Elde edilen sonuç sinyali,
çözeltideki madde konsantrasyonu ile orantılıdır.
Şekil-4: Bir çift dalga boylu spektrofotometrenin şeması
Çift-dalga boylu
spektrofotometrelerin bir diğer kullanım alanı kinetik çalışmalardır; bu
yöntemle iki maddenin konsantrasyonları izlenebilir. Ayrıca bulanık ortamlarda
bulunan bir maddenin absorbsiyon spektrumu da aynı yöntemle çizilebilir.
Diferensiyal
Absorbsiyon Yöntemleri
Fotometre ve spektrofotometrelerin
çoğunda alınan sonuçların doğruluğu okuma sisteminin hassasiyetine bağlıdır.
Geçirgenlik (T) ölçümündeki hata (sT) sabittir ve bağıl (relatif)
konsantrasyon hatası aşağıdaki eşitlikle verilir.
Diferensiyel yöntemlerde okumalar
genişletilmiş skalada yapılarak bu nedenle olacak hatalar en aza indirilir. Bu
yöntemlerde cihazın sıfır ve/veya %100 geçirgenlik ayarları kapak ve solvent
kullanılarak değil maddenin çözeltisi ile yapılır. Tablo-1'de üç diferensiyal
yöntemin normal yöntem ile kıyaslaması yapılmıştır.
Şekil-5: Spektrofotometrik analizlerde relatif hatalar (A,
B, C eğrilerinin genişletilmiş skaladaki T değerleri Şekil-6’da verilmiştir)
Tablo-1: Absorbsiyon Ölçme Yöntemlerinin
Kıyaslamaları
Kıyaslamaları
Yüksek-Absorbans
Yöntemi
Yüksek absorbans yönteminde sıfır
ayarı bilinen kapak sistemiyle yapılır; kaynakla dedektör arasına bir kapak
konularak ışının dedektöre geçmesi engellenir. % 100 T ayarı için ise, analizi
yapılacak maddenin, örnekten daha az konsantre bir standardı ışık yolu üzerine
konulur ve geçirgenlik %100 e ayarlanır. Son olarak standart çıkarılır yerine
örnek hücresi konur ve relatif geçirgenlik doğrudan okunur. Şekil-6(a)'da
görüldüğü gibi bu değişikliğin etkisi geçirgenlik skalasının küçük bir
bölümünü, %100 olocak şekilde genişletmektir; böylece Şekil-6a)'nın üst skalasında
görüldüğü gibi kullanılan referans standardının geçirgenliği, "saf solventle
kıyaslandığında" %10 olduğu halde, örneğin geçirgenliği %4'dür (aynı solvente
karşı). Yani, örneğin geçirgenliği standardın geçirgenliğinin onda dördüdür.
Standart yerine referans konulması halinde geçirgenlik %100 olacaktır (Şekil-6a'daki
alt skala). Örneğin geçirgenliği (referans standardın onda dördü) burada okunan
%40 değeri ile aynıdır.
Absorbans ölçümünde cihaz hatası
skala değiştirme işleminden etkilenmezse, standardın referans olarak
kullanılmasıyla geçirgenlik skalanın orta kısmına ayarlanabilir, burada cihaz
hatasının relatif konsantrasyon hatasına etkisi çok azdır.
Konsantrasyon ile yüksek-absorbans
yöntemiyle ölçülen relatif absorbans arasında doğrusal bir ilişki vardır. Bu
yöntem, özellikle absorbans değerleri 1 den yüksek olan örneklerin analizinde
faydalıdır.
Düşük - Absorbans
Yöntemi
Bu yöntemde sıfır ayarı için kapak
yerine örnekten biraz daha derişik bir standart çözelti kullanılır; %100 ayarı
ise ışık yolu üzerine çözgen hücresi konularak yapılır. Örneğin geçirgenliği
solvent hücresi çıkarılıp yerine örnek hücresi konularak ölçülür. Bu işlemin
etkisi Şekil-6b'de verilmiştir; burada da 4.4.1'de olduğu gibi skalanın küçük
bir bölümü %100 geçirgenliğe genişletilmiştir, örneğin geçirgenliği ise
genişletilmiş skalanın orta kısımlarında bulunur.
Düşük absorbsiyon yöntemi
özellikle absorbansı 0.1'den küçük olan örneklere uygulanır. Burada bağıl
absorbans ile konsantrasyon arasındaki ilişki doğrusal değildir. Bu nedenle
analizde kullanılacak kalibrasyon eğrisinin çizilmesinde çok sayıda standart
çözeltiye gereksinim vardır.
Şekil-6: Çeşitli
yöntemlerle skala genişletilmesi; (a) yüksek absorbans, (b) düşük (zayıf)
absorbans, (c) çok yüksek (maksimum) hassasiyet yöntemleri
Çok Yüksek Hassasiyet Yöntemi
Çok yüksek hassasiyet yönteminde
yukarıdaki iki teknik bir arada kullanılır. Şekil-6c'de görüldüğü gibi yine
skala genişletilmesi yapılır; burada iki referans çözelti vardır. Bunlardan
biri %100 ayarının yapılmasında kullanılır ve geçirgenliği örnekten daha fazla
olan referans 1, diğeri %0 geçirgenlik ayarında kullanılan ve geçirgenliği
örneğin geçirgenliğinden daha az olan referans 2'dir. Burada da relatif
absorbsiyon ile konsantrasyon arasındaki ilişki doğrusal değildir.
Diferensiyal
Yöntemlerle Hassasiyetin Artırılması
Şekil-5'de üç diferensiyal
absorbsiyon yöntemindeki eğriler, basit yöntemdeki hata eğrisi ile
kıyaslanmıştır. A eğrisinden görüldüğü gibi, absorbansı yüksek (veya
geçirgenliği düşük) örneklere yüksek-absorbans yöntemi uygulanırsa hassasiyet
artar. A eğrisi geçirgenliği %10 olan referans standart kullanılarak
çizilmiştir (Şekil-5a). Referansın % geçirgenliği artıkça ve %100'e ulaştığında
hata eğrisi basit yöntemdeki (O eğrisi) şekli alır. Düşük-absorbans (B eğrisi)
ve çok yüksek hassasiyet (C eğrisi) yöntemlerinin eğrileri Şekil-6(b) ve 6(c)'deki
verilere göre çizilmiştir.
Hassasiyet
Yöntemlerinde Cihaz Koşulları
Düşük-absorbans yönteminde,
fotoelektrik dedektöre ışın çarpmadığı zaman üretilenden daha büyük akımları
yok edecek bir ölü-akım dengeleme devresi gerekir. Yüksek-absorbsiyon yöntemi
için ise, cihazın, ışık yoluna bir absorbsiyon çözeltisi konulduğunda
göstergenin %100 geçirgenliğe ayarlanabilmesini sağlayacak yeterli bir reserv
kapasiteye sahip olması gerekir. Tüm skala okuması, ya ışın şiddeti artırılarak
(slit açıklığı büyütülür) veya fotoelektrik akımın amplifikasyonu artırılarak
sağlanır. Çok yüksek hassasiyet yönteminin uygulandığı cihazlarda bu iki
özelliğinde bulunması gerekir.
Bir spektrofotometrenin ışın yolu
üzerine absorblayıcı bir çözelti konulduğunda %100 skala ayarı yapabilme
kapasitesi monokromotörün kalitesine ve elektronik devrenin kararlılığına
bağlıdır. Ayrıca, dalga boyu değiştikçe ışının şiddeti ve dedektörün
hassasiyeti de değiştiğinden bu kapasite dalga boyuna da bağımlıdır. Işın
şiddetinin ve dedektör hassasiyetinin düşük olduğu bölgelerde %100 ayarı için
slit açıklığının artırılması gerekir; bu gibi durumlarda monokromatörün
kalitesi yüksek olmalıdır, aksi halde ışın saçılması olur ve bu nedenle de
hatalar oluşur. Başka bir seçenek akım yükseltme derecesinin çok
artırılmasıdır; bu durumda da iyi bir elektronik kararlılık gerekir, yoksa
önemli fotometrik hatalar ortaya çıkar.
