1.
Spektrofotometrik Analizlerin Hassasiyetinde Cihaz Gürültüsünün Etkisi
Spektrofotometrik analizin doğruluğu ve hassasiyeti,
cihazdan gelen kararsızlıklar ve gürültü nedeniyle çoğu zaman sınırlıdır. Cihaz
gürültüsünün spektrofotometrik ölçmelerin hassasiyetine etkisini anlayabilmek
için, önce bunların öğrenilmesi yararlı olacaktır.
Bir spektrofotometrik ölçme üç aşamada gerçekleştirilir: %0
T ayarı, %100 T ayarı ve örneğin %T değerinin ölçülmesi. Bu aşamaların her
birinde oluşabilecek kararsızlıklar birleşerek son okuma %T değerinde değişik
okumalara neden olur. Bu farklılık Beer kanunundan çıkarılabilir. Beer kanununu
aşağıdaki şekilde yazalım.
Bu denklemin b ve c sabit olduğu haldeki kısmi türevi
aşağıdaki gibidir.
Burada dc, enstrumanda gürültü veya kararsızlık olması halinde T
değerinin dT
kadar değişmesi durumundaki c konsantrasyonundaki değişikliktir. Bu denklemin
ilk denklemle bölünmesiyle aşağıdaki eşitlik elde edilir.
Üç ölçme kademesinde T'de olabilecek "relatif"
kararsızlık (hata) veya gürültü dT/T ile,
konsantrasyondaki hata ise dc/c ile gösterilir. Gürültü dT'nin en iyi ölçümü standart sapma sT
ile saptanır; standart sapma, bir seri ölçme için şu şekilde verilir.
Burada Ti , N defa yapılan ölçmelerde T için
okunan değerlerin her biri, T ise tüm okumalar için hesaplanan ortalama
değerdir. Denklem(12) den relatif standart sapma konsantrasyon cinsinden ifade
edilebilir (sc/c).
Deneysel olarak sT bulunabilir; örneğin T için 20
okuma (N = 20) yapılmış olsun, bu değerler sT için verilen eşitlikte
yerine konarak sT hesaplanır.
Denklem(14)'ün incelenmesinden, fotometrik bir konsantrasyon
ölçümündeki konsantrasyonun geçirgenliğin büyüklüğü ile karmaşık bir bağıntıda
olduğu görülür. Hatta gerçekteki durum Denklem(14)'dekinden daha da karmaşıktır
çünkü sT 'de, pek çok koşulda T'ye bağımlıdır.
Rothmon, Crough ve İngle detaylı teorik ve deneysel
çalışmalarında birkaç enstrumental kararsızlık kaynağını tarif etmişler ve
bunların absorbans veya transmittans ölçümlerindeki net etkilerini
göstermişlerdir. sT nin büyüklüğü, T ile orantılıdır, (T2 + T)1/2
ile orantılıdır veya T’den bağımsızdır. Tablo-2'de bu kararsızlık kaynakları
özet olarak verilmiştir. Her tip kaynağın konsantrasyon hatasının büyüklüğüne
etkisi açıkça görülmektedir.
Bir spektrofotometrik yöntemin hata analizinde ne tip hata
kaynaklarının olabileceği iyice bilinmelidir.
1.
%0 T Kararsızlığı (Hatası): Tablo-2'de
görüldüğü gibi %0 T hatası transdüserler ve amplifikatörlerle ilgili üç tip
hatayı kapsar; adından da anlaşıldığı gibi, bunlar T = %0 ayarının yapılmasıyla
ilgilidir. Bu tip hatar ışının dedektöre gitmesini engelleyen kapaktan ışın
sızması, kapağın hareketiyle oluşan titreşim etkileri, ve transduser ve
amplifier sistemlerindeki sıcaklık dalgalanmalarından kaynaklanır. Modern
spektrofotometrelerde cihazın uç dalga boylarının dışındaki bölgelerde %0 T
gürültüsü çoğu zaman önemli değildir; uç dalga boylarında Denklem(5)'deki K’
değeri KP ve KP0 'a yaklaşır. %0 T gürültüsü T’nin büyüklüğüne
bağlı değildir.
2.
Johnson Gürültüsü: Johnson
gürültüsü, dirençli devre elemanlarındaki elektronların ısı tesiriyle
hareketlenmelerinden kaynaklanır. Bu hareket, direnç elemanda belirli bir yönde
ilerleyen elektronların ortalama sayısını aniden artırır veya azaltır.
Tablo-2: Spektrofotometrik Ölçmelerde Karşılaşılan Kararsızlık (Hata)
Kaynakları
sT,
T ‘den bağımsız
|
sT
= k’ (T2 + T)1/2
|
sT
= k’’ T
|
%0 T gürültü
|
Dedektör vurma gürültüsü (sadece foton dedektörler)
|
Kaynak fliker gürültüsü
|
Ölü akım vurma gürültüsü
|
Hücre durumu kararsızlığı
|
|
Ölü akım fazla gürültüsü
|
||
Amplifikatör fazla
gürültüsü
|
||
Dedektör Johnson gürültüsü ((sadece termal
dedektörker)
|
||
Sınırlı okuma rezolusyonu
|
||
Amplifikatör vurma gürültüsü
|
Tablo-3: Çeşitli
Düzensizlik Kaynakları İçin Geçirgenlik ve Absorbansın Fonksiyonu Olarak
Relatif Konsantrasyon Hataları
Geçirgen-lik, T
|
Absor-bans, A
|
Relatif Hata
|
||
Ölçmelerde Sınırlar
|
||||
T = % 0
veya Johnson
gürültüsü(a) |
Sinyal
vurma gürültüsü(b) |
Fliker
gürültüsü(c) |
||
0.95
|
0.022
|
± 6.2
|
± 8.4
|
± 5.8
|
0.90
|
0.046
|
± 3.2
|
± 4.1
|
± 2.8
|
0.80
|
0.097
|
± 1.7
|
± 2.0
|
± 1.3
|
0.60
|
0.222
|
± 0.98
|
± 0.96
|
± 0.59
|
0.40
|
0.398
|
± 0.82
|
± 0.61
|
± 0.33
|
0.20
|
0.699
|
± 0.93
|
± 0.46
|
± 1.18
|
0.10
|
1.00
|
± 1.3
|
± 0.43
|
± 0.13
|
0.032
|
1.50
|
± 2.7
|
± 0.50
|
± 0.09
|
0.010
|
2.00
|
± 6.5
|
± 0.65
|
± 0.06
|
0.0032
|
2.50
|
± 16.3
|
± 0.92
|
± 0.05
|
0.0010
|
3.00
|
± 43.4
|
± 1.4
|
± 0.04
|
(a) Denklem (14)den sT = ±
0.003 kullanılarak
|
||||
(b) Denklem (16)dan k’ = ±
0.003 kullanılarak
|
||||
(c) Denklem (18)den k’’ = ±
0.003 kullanılarak
|
||||
Jonhson gürültüsü akımın büyüklüğüne bağlı değildir;
gerçekte, akım olmadığı zaman ortaya çıkar. Johnson gürültüsü, fotometreler ve
spektrofotometrelerin tüm dedektör ve elektronik kısımlarında bulunur. Diğer
gürültü kaynaklarına kıyasla çok küçüktür ve tüm pratik uygulamalarda ihmal
edilebilir; İstisna, IR ışın veren ısıl dedektörleridir. Bu dedektörlerle
çalışıldığında Johnson gürültüsü spektral ölçmelerin hassasiyetini sınırlayacak
kadar etkili olur. Tersine UV ve görünür bölgelerdeki Johnson gürültüsü
fototüplerde, fotomultiplier tüplerde, ve amplifikatörlerde olduğundan,
ölçmeleri etkilemez.
3.
%0 T ve Johnson Gürültüsünün Etkileri: Belirtildiği gibi Johnson gürültüsü ve %0 T gürültüsünün
büyüklüğü, transmittansdan bağımsızdır. Yani, Denklem(14) deki sT,
T’den "bağımsız" dır ve sT nin sc ye etkisi
saptanırken sabit kabul edilebilir. Bir cihazın sT değeri, bir
absorbsiyon çözeltisinin 20-30 bağımsız ölçümleri için standart sapma hesapları
yapılarak saptanır.
Tablo-3'deki 3.kolon hassasiyeti Johnson veya %0 T gürültüsü
ile sınırlanmış bir spektrofotometrede karşılaşılan konsantrasyondaki relatif
hatayı gösterir. Burada, transmittanstaki mutlak kararsızlık sT =
±0.003 veya %±0.3 T'dir. Bu veriler Şekil-6'daki A eğrisini verir, görüldüğü
gibi, c’nin relatif standart sapması, absorbans 0.4 dolayında olduğunda bir
minimuma ulaşır. (Denklem-14'ün türevi sıfıra eşitlenerek, min. 0.434
absorbansta veya 0.368 transmittansta gerçekleştiği görülebilir.)
Ticari spektrofotometrelerin çoğunda transmittanstaki
standart sapma ±0.0001 ile ±0.01 (T=%0.01 ile 1) arasında değişir; düşük
değerlere yüksek-kaliteli Ultraviyole görünür ışık cihazlarında rastlanırken
fazla pahalı olmayan infrared cihazlarda yüksek değerler gözlenir. Tablo-3'deki
±0.003 değeri orta kaliteli %0 T veya Johnson gürültüsü olan cihazlar için
tipiktir; konsantrasyon hataları 0.15 -1.0 aralığındaki absorbsiyonlarda
relatif %1-2 kadardır. Daha kuvvetli absorbsiyon ortamlarında hata da büyük
olacağından, ölçme işleminden önce örnek yeteri kadar seyreltilmelidir. Ancak
absorbansın 0.1 den daha küçük olması durumunda relatif hatalar %2'nin üstüne
çıkar (Şekil-6).
Bu yorumlarda, bir analizdeki sınırlayıcı kararsızlıkların,
transmittanstan bağımsız olduğu varsayılmıştır; bu tip kararsızlık, ısıl
dedektörlü cihazlarda bulunur.
4.
Okuma Resolusyonundan (Ayırma Yeteneğinden) Gelen Sınırlandırma: Bazı Ticari Spektrofotometrelerin
hassasiyeti okuma aletlerinin resolusyonu ile sınırlandırılmıştır. Örneğin,
toplam skalasının ±% 0.5'i kadar bir hassasiyetle okumaya olanak veren bir
cihazın kararsızlığı (sT) ±0,005 T dir. Bu kararsızlık T'ye bağımlı
da değildir; Bu nedenle, konsantrasyondaki relatif hataya etkisi %0 T ve Johnson
gürültüsünde olduğu gibidir ve Denklem(14) ile tanımlanır. Bu denklemde sT
yerine 0,005 konularak konsantrasyon verileri hesaplanır, %1.5-3 arasındaki
kararsızlık relatif geçirgenliği %10-80 aralığında sınırlandırılır.
5.
Sinyal Vurma (Titreşim) Gürültüsü:
Daha önce de işaret edildiği gibi vurma gürültüsü, bir fotomultiplier tüpün
katodundan anoduna doğru, veya engelli-tip bir fotoselin bağlantıları boyunca
olan elektronların hareketiyle oluşan elektrik akımında gözlenir. Burada oluşan
akım bir seri ayrı kuvantize değerlerin sonucudur (bir katottan elektronların
emisyonu); birim zamandaki çeşitli kuvantize değerler ortalama bir değerin
etrafında rasgele dağılmıştır. Akımdaki dalgalanmalarının büyüklüğü akımın kare
kökü ile orantılıdır. Daha önce incelenen gürültü tiplerinin tersine vurma
gürültüsü, ölçülen miktarın büyüklüğünün artması ile beraber artar. Sonuç
olarak Denklem(4) deki sT, T'nin fonksiyonudur. Vurma gürültüsünün sT
ve sc ye etkisi, aşağıdaki örnekte görüldüğü gibi, bulunabilir.
ÖRNEK
sT ve sc ‘nin vurma gürültüsü ile
ilişkisini gösteren bir bağıntının çıkarılması.
Vurma gürültüsü, geçirgenlik veya absorbans ölçmelerinde
yapılan üç işlemde de vardır. %0 T ayarındaki gürültü P ve P0
ölçümlerindeki gürültülere göre daha küçüktür, çünkü, gürültü artışı sinyalin
kare kökü ile orantılıdır. Bu nedenle T'deki kararsızlığı P ve P0
ölçmelerindeki gürültü belirler. T bu iki değerle çevrildiğinden relatif
standart sapması, P ve P0'ın relatif standart sapmalarından elde
edilebilir. Buna göre,
Vurma gürültüsü ölçülen değerin karekökü ile orantılı olduğundan,
yazılabilir, k orantı sabitidir. Bu iki eşitliğin ilk denklemde yerine konulmasıyla sT denklemi çıkarılır.
Denklem(15), (14)’de yerine konularak Denklem(16) bulunur.
Tablo-3'de 4.kolondaki veriler Denklem(16) ile
hesaplanmıştır. Verilerin grafiği Şekil-6'daki B eğrisi ile gösterilmiştir.
Hassasiyeti, Johnson veya %0 T gürültüsünden çok vurma gürültüsünün sınırladığı
durumda, çalışılabilen (doğru olarak) absorbans aralığı daha geniştir. Johnson
veya %0 T gürültüsünün sınırladığı cihazlarda olduğu gibi, vurma-sınırlı
cihazlarda da %95'ten büyük geçirgenliklerde (A<0.02) güvenilir
konsantrasyon değerleri alınamaz.
Sinyal vurma gürültüsü, ultraviyole ve görünür ışık
fotometre ve spektrofotometrelerde yapılan transmittans veya absorbans
değerlerinin doğruluğunu bazen sınırlarlar. Bu durum infrared cihazlarda
önemsiz seviyelerdedir.
6.
Flicker Gürültüsü: Flicker
gürültüsü, büyüklüğü, gözlenen sinyalin frekansı ile ters orantılı olan bir
gürültüdür; buna bazan "1/f" gürültüsü de denir. Flicker gürültüsü
100 Hz ‘den düşük frekanslarda önemlidir. DC amplifikatörleri, metreler ve
galvanometrelerin uzun süreli kullanımlarında flicker gürültüsü çıkar.
Fotometreler ve spektrofotometrelerdeki Flicker gürültüsü,
büyük ölçüde, ışın kaynağından ileri gelir. Flicker gürültüsünün büyüklüğü
teorik olarak bulunamaz. Kaynaktan gelen kararsızlıklar,
eşitliği ile tarif edilir Denklem(14) bu değerin yerine
konulmasıyla aşağıdaki şekilde yazılır.
Tablo-3 5.kolonda ve Şekil-6'daki C eğrisinde Flicker gürültüsünden kaynaklanan konsantrasyon hatası, yüksek absorbanslarda hızla düşer ve sıfıra ulaşır.
Düşük absorbansta bir spektrofotometrik ölçmedeki toplam
kararsızlık, çoğunlukla, Flicker gürültüsü ile daha önce incelenen gürültülerin
toplamından oluşur; diğer üçünün katkısının az olduğu durumlar nadirdir.
7.
Hücrenin Durumundan Gelen Kararsızlık: Tüm hücrelerde ufak tefek kusurlar vardır. Bu nedenle, kaynakla
hücrenin değişik kısımlarının yüz yüze gelmesiyle farklı yansıma ve saçılma
kayıpları olur; ölçülen transmisyonda da bu farka uygun değişikliklerin olması
kaçınılmazdır. Yüksek-kaliteli hücrelerde bu tip kusurlar en düşük düzeydedir.
Hücreler çizilmiş ve kirliyse geçirgenliğin
hücrenin durumuna olan bağımlılığı önemli derecede artar.
Rothman, Crouch, ve Ingle hücrenin durumundan gelen
kararsızlıkların, kaynak Flicker gürültüsüyle ayni davranışta olduğunu
göstermişlerdir; yani, sT, geçirgenlik ile orantılıdır ve
konsantrasyon kararsızlığı Denklem(18)'le verilir. Hücrelerin temizlenmesi ve
yerleştirilmesinde çok dikkatli davranılması halinde bile hata kaynakları yok
edilemez. Spektrofotometrik ölçmelerde doğruluğu etkileyen (sınırlayan) en
önemli faktör hücrelerin durumudur. Bu etkiyi azaltacak bir yöntem, kalibrasyon
ve analiz süresince hücrelerin yerinden hiç çıkarılmamasıdır; hücrelerin
yıkanması, çalkalanması, ve yeni standartlar ve örneklerin konulması, hücreler
çıkarılmadan bir şırınga ile yapılır.
Sonuç olarak, özetlenirse, bir spektrofotometrik analizde
karşılaşılan rasgele hatalar çeşitli değişkenlerden kaynaklanır; bunlar,
enstrumanın dizaynı, dalga boyu aralığı, kaynağın şiddeti ve kararlılığı,
transdüserin hassasiyeti, slit genişlikleri, ve analitin konsantrasyonudur.
Kaydedici cihazlarda, spektrum kaydedilirken bu değişkenlerin bazıları
değişebileceğinden durum daha da karmaşık bir hal alır.
İnfrared cihazlar, en çok Johnson gürültüsüyle
(dedektörlerinden dolayı) ve hücre yapısı ile sınırlandırılırlar. IR
çalışmalarda, çoğunlukla, ışık yolu çok kısa olan dar hücreler kullanılır. Bu
nedenle hücrenin bir kısmındaki örnek kalınlığı, diğer kısımlarındakinden
farklı olur. Ayrıca, IR hücreler çok kolay bozulur ve atmosferden etkilenirler;
yüzeylerin durumuna göre geçirgenlik farklılıklar gösterir. Kaynak Flicker’i de
IR ölçmelerdeki kararsızlığı artırır, fakat Johnson gürültüsü ve hücre kararsızlıklarına
göre önemsizdir.
Çeşitli UV ve görünür ışık fotometreler ve
spektrofotometreler arasında farklı davranışlar görülür. En iyi kaliteli
cihazlardaki sınırlayıcı rasgele hata kaynağı hücre durumundan gelen
kararsızlıktır. Bu cihazlarda hücrelerin doldurulup boşaltılma işlemlerinin,
hücreyi yerinden çıkarmadan yapılması hatayı azaltan önemli bir önlemdir; yine
de, hücre kararsızlığı bu cihazların performansını sınırlar.
2.
Absorbsiyon Ölçmelerine Slit Genişliğinin Etkisi
Bir spektrofotometrenin birbirini takip eden absorbsiyon
bantlarını ayırma yeteneği kullanılan slit genişliğine bağlıdır. Karmaşık bir
spektrumda detayları görebilmek için dar slitler gerekir. Şekil-7'de geniş slit
kullanılması halinde spektral detayların nasıl kaybolduğu görülmektedir. Bu
örnekte didmiyum camının spektrumu incelenmiştir; slit ayarları 0.5, 9 ve 20 nm
genişlikte bandlar verecek şekilde değiştirilmiştir.
Paraseodyum klorür çözeltisinin 1.0, 0.5 ve 0.1 mm slit
açıklıklarında çizilen spektrumları Şekil-8'de verilmiştir. Burada pik
absorbans değerlerinin, slit genişliğinin artmasına parelel olarak yükseldiği
görülmektedir. Slit açıklığının 0.14 mm den daha küçük olması hallerinde,
absorbansın slit genişliğine bağlı olmadığı da deneylerle saptanmıştır.
Şekil-7'nin dikkatle incelenmesi, burada da benzer bir etkinin
olduğunu gösterir. Değişik slit genişliklerinde, iki spektrum takımında da
(Şekil-7 ve 8) her bir pikin altında kalan alanın aynı olduğu, sadece slit
genişliğine göre piklerin yayvan veya dik bir şekilde bulunduğu görülmektedir.
Bu açıklamalara göre, dar absorbsiyon bandlarının gerekli
olduğu kantitatif ölçmelerde küçük slit açıklıklarıyla çalışılmalıdır. Slit
açıklığı, pik yüksekliği sabit kalıncaya kadar yapılan slit ayarı değişikliği
ile saptanır. Slitin gereğinden fazla daraltılması, spektrofotometrenin
bandları ayırma gücünü azaltır.
Şekil-7: Spektral detaylara band
genişliğinin etkisi; örnek didmiyum camıdır
Şekil-8: Slit genişliği ve band
genişliğinin pik yüksekliğine etkisi
3.
Bir Spektrofotometrenin Uç Dalga Boylarındaki Ölçümlerine Saçılmış Işının Etkisi
Saçılmış ışın da Beer Kanununda enstrumental sapmaya neden
olur. Ölçmelerin, bir cihazın alt ve üst dalga boyu limitlerine yakın dalga
boylarında (uç dalga boyları) yapılması halinde, başıboş ışının etkisi daha da
önemli bir duruma gelir ve yanlış absorbsiyon pikleri oluşur.
Örneğin, cam optikli, tungsten kaynaklı, ve fotosell hücreli
görünür ışıkta çalışan bir spektrofotometrede 380 nm’nin altındaki dalga
boylarında pencereler, hücreler, ve prizma ışın absorblamaya başlar, böylece
transdusere giden ışının enerjisi zayıflar. Kaynak çıkışı düşer ve fotoelektrik
sistemin hassasiyeti azalır; 500-650 nm arasındaki bölgede %100 T ayarı için
gerekli ışın gücü %1- 2 kadar azalır.
Görünür bölgenin uç dalga boylarında elde edilen hatalı
piklere bir örnek Şekil-9'da verilmiştir. B eğrisi ceryum(4) çözeltisinin
200-700 nm aralığında hassas bir ultraviole-görünür spektrofotometrede alınmış
spektrumudur. A eğrisi aynı çözeltinin daha basit bir görünür spektrofotometredeki
eğrisidir. A eğrisinde görülen pik maksimumu, cihazın 400 nm'den büyük dalga
boylarındaki başıboş ışını algılamasından oluşmuştur; bunlar seryum(4) iyonları
tarafından absorblanmamışlardır.
Aynı etki ultraviyole-görünür ışık spektrofotometrelerde 200
nm'nin altındaki dalga boylarında ölçme yapıldığında görülür.
Şekil-9: Ceryum(4)ün; A cam optikli,
b kuvartz optikli spektrofotometreler ile alınmış spektraları; A’daki hatalı
pik uzun dalga boylarındaki başıboş ışının geçmesinden oluşur
