Kromatografi; Genel Tanımı (general description)

Kromatografi, kompleks karışımlardaki çeşitli maddeleri birbirinden ayırmaya ve tanımlamaya olanak veren ve bilim adamlarının çalışmalarını kolaylaştıran bir seri ayırma yöntemleri tekniğidir. Tüm kromatografik uygulamalarda bir "sabit faz" ve bir "hareketli faz" bulunur. Bir karışımdaki maddeler hareketli faz ile sürüklenerek sabit faz üzerinden taşınır; Örnekteki maddelerin göç etme hızlarının farklı olması, her bir maddenin sabit faz üzerinde gruplaşarak ilerlemesine yol açar, böylece karışım içindeki maddeler birbirinden ayrılırlar.

1. Sabit Faz Tipleri

Kromatografide, ayrılacak maddeler hareketli fazda çözünebilmeli ve sabit faz ile de bazı etkileşimlerde bulunabilmelidirler; Örneğin, sabit fazda çözünme, adsorblanma veya kimyasal reaksiyona girme gibi. Ayırma işlemi süresince maddeler iki faz arasında dağıtılırlar.

Bazı uygulamalarda sabit faz, ince bir cam veya metal çubuk içine doldurulmuş toz halinde katı bir maddedir. Gaz veya sıvı haldeki hareketli faz basınç altında (veya kendi ağırlığı ile) katı içinden geçirilir. Bu yönteme " kolon kromatografisi" denir. Bir de "düzlemsel kromatografisi" vardır; bunda sabit faz poröz bir kağıt veya bir cam levha üzerine yayılmış ince toz halinde katı bir maddedir. Düzlem kromatografisinde hareketli faz kapiler etkisi veya kendi ağırlığı ile sabit faz üzerinde ilerler. 

Sabit faz, hareketli fazla karışmayan ve akıcı olmayan bir sıvı da olabilir. Bu durumda sabit sıvı fazı bir yerde tutabilmek için çeşitli yöntemler uygulanır. Örneğin, toz halindeki bir katının üzerine bir sabit faz sıvısından ince bir tabaka kaplanır ve kaplanmış katı madde bir cam veya metal tüpe doldurulur; hareketli faz bu tüpten geçirilir. Burada katı maddenin ayırma işleminde herhangi bir rolü yoktur, sadece faz sıvısını tutma (adsorblayarak) görevi yapar. Başka bir yöntemde sabit sıvı faz bir kapiler tüpün cidarlarına kaplanarak tutulur, gaz hareketli faz bu tüpten geçirilir. Bir diğer yöntemde ise sabit sıvı fazı tutmak için kağıt lifleri veya üzerinde çok ince öğütülmüş katı tanecikler bulunan bir cam levha kullanılır.

Tablo-1'de, sabit ve hareketli fazların yapılarına göre uygulanan çeşitli kromatografik yöntemler verilmiştir. Bu kısımda dağılma (partisyon) ve gaz-sıvı kromatografisi anlatılacaktır. Gerekli değişiklikler yapılarak bu kavramlar diğer yöntemlere de uygulanabilir.

Tablo-1: Kromatografik Ayırmaların Sınıflandırılması

Adı	Hareketli faz tipi	Sabit faz tipi	Sabit fazı tutma yöntemi
Gaz-sıvı	Gaz	Sıvı	Bir tüp içindeki poröz katı üzerinde veya kapiler bir tüpün iç cidarı üzerinde adsorblanır
Gaz-katı	Gaz	Katı	Bir kolon (tüp) içinde tutulur
Dağıtma	Sıvı	Sıv	Bir kolon (tüp) içindeki poröz bir katı üzerinde adsorblanır
Adsorbsiyon	Sıvı	Katı	Bir kolon (tüp) içinde tutulur
Kağıt	Sıvı	Sıvı	Kalın bir kağıdın gözenekleri içinde tutulur
İnce tabaka	Sıvı	Sıvı-katı	Bir cam levhadaki ince toz halindeki katı üzerinde tutulur
Jel	Sıvı	Sıvı	Polimerik bir katının lifleri arasında tutulur
İyon değiştirme	Sıvı	Katı	Bir kolondaki (tüp) iyon değiştirici reçine üzerinde tutulur

2. Doğrusal Kromatografi

Tüm kromatografik ayırmalar hareketli ve sabit fazlar arasında dağılan maddelerin değişik yayılma (hareket) özelliklerine dayanır. "Dağıtma katsayısı, K" denilen ve sıcaklığa bağımlı bir sabit ile kantitatif bir denklem verilebilir.

Burada C_S maddenin sabit fazdaki analitik konsantrasyonu, C_M ayni maddenin hareketli fazdaki konsantrasyonudur. İdeal halde, geniş bir madde konsantrasyonu aralığında dağılma kat sayısı sabittir; yani C_S, C_M ile doğru orantılıdır. Çok sık olmasa da C_S ile C_M arasında doğrusal olmayan bir ilişkiyle karşılaşılabilir. Şekil-1'de bazı tipik dağılma eğrileri verilmiştir.

Şekilde görülen C eğrisi ideal bir hali gösterir. Bu eğri ayrışma (disosiyasyon) veya birleşme (asosiyasyon) reaksiyonları bulunmayan ve birbiriyle karışmayan iki sıvı arasındaki dağılma dengesine yaklaşır. B ve D eğrileri böyle bir dengenin bulunduğu hale daha çok benzerlik gösterirler. Örneğin, eğer sabit faz su hareketli faz da benzen ise, zayıf bir organik asit içeren bir madde için B’de görülen şekilde bir eğri elde edilir. Burada benzen içinde sadece disosiye olmayan asit çözünürken, sulu çözeltide bir miktar disosiye olmayan asit ile onun konjuge bazı da bulunur; asit ve konjuge baz asındaki oran konsantrasyona bağımlı değildir. Bu nedenle düşük konsantrasyonlarda, toplam asitin az bir miktarının iki solvent arasında dağılması yeterlidir ve dağılma katsayısı büyüktür. Diğer taraftan, eğer hareketli faz benzen değil de su ise D'deki gibi bir eğri elde edilir. Buharın hareketli fazı olduğu buhar-sıvı dengelerinde de eğriler B şeklindedir.

Şekil-1: Tipik dağılma eğrileri; C_S, maddenin sabit fazdaki konsantrasyonu, C_M, aynı maddenin hareketli fazdaki konsantrasyonu

A eğrisi tipik bir "adsorbsiyon izotermi" dir ve bir katı yüzey üzerinde adsorblanan madde miktarının, katının temasta olduğu çözeltideki madde konsantrasyonu ile olan ilişkisini gösterir. Madde konsantrasyonu arttıkça katı yüzeyde adsorbsiyon da artar ve bu durum yüzeyin adsorblama kapasitesi doluncaya kadar devam eder; sonra madde konsantrasyonundan bağımsız hale gelir. Bu tip eğriler k ve n sabit olmak üzere, aşağıdaki eşitlikle tanımlanır.

Fraksiyonlama proseslerinde uygulanabilir bir denklem elde edebilmek için yaklaşık bir K sabiti kullanılır. Şekil-1'deki dört eğrinin de düşük konsantrasyonlar aralığında doğrusal olması, sınırlı bir bölgede yaklaşık K değerinin kullanılmasının önemli hatalara neden olmayacağını gösterir. Geniş konsantrasyon aralıklarında ise yukarıdaki denklem, madde konsantrasyonunun K ‘da yapacağı değişiklikler dikkate alınarak değiştirilir. Bir kromatografik kolondaki konsantrasyon, çoğunlukla düşüktür. K 'nın sabit olduğu bu koşullarda alınan kromatograflara "doğrusal kromatografi" denir. Bu bölümde, bu tip kromatograflar ele alınacaktır.

3. Doğrusal Sıyırma Kromatografisi

Sıyırma (elusyon) kromatografide, bir miktar örnek önce hareketli fazda (solvent) çözülür ve hazırlanan çözelti kolona verilir (Şekil-2); kolonda, örneğin içerdiği maddeler kendi kendine iki faz (hareketli ve sabit) arasında dağılır. Çözelti injeksiyonundan sonra kolona bir miktar saf halde hareketli faz (sıyırıcı) verilir. Sıyırıcı olarak çalışan bu kısım, çözeltiyi kolonun alt kısımlarına doğru iter: böylece hareketli faz (içinde hala sabit faza geçecek kısımlar vardır) ile aşağı kısımlardaki taze sabit faz arasında daha ileri derecelerde dağılma sağlanır. Ayni anda taze hareketli faz ile üst kısımlardaki sabit faz (içinde hareketli faza geçecek kısımlar vardır) arasında da yeniden dağılma olur. Sürekli olarak taze çözgen ilave edilerek örnekdeki moleküller, hareketli ve sabit fazlar arasındaki geçişlerle kolonun altına kadar taşınır. Maddedeki moleküller sadece hareketli faz eşliğinde ilerleyebildiklerinden, bir maddenin ortalama göçme (ilerleme) hızı, onun hareketli fazda kalma süresine bağlıdır.

Bu süre, maddelerin dağılma oranlarından anlaşılabilir; sabit fazdaki madde konsantrasyonu yüksekse süre kısa, hareketli fazdaki konsantrasyon yüksekse süre uzundur. En ideal hal, hızlar arasındaki farkların, bir karışımdaki maddeleri kolon uzunluğu boyunca ayrı bantlar halinde ayırabildiği durumdur. (Şekil-2 ve 3). Kolondan yeteri kadar hareketli faz geçirilerek bölgeler halinde toplanmış maddeler kolondan sıra ile çıkarılır ve kendilerini tanımlayan bandlar halinde kaydedilir. Başka bir yöntemde, her maddenin toplandığı kolon dolgu maddesi bölgesi ölçülerek hesapla sonuca gidilir.

Kolona verilen örneğin taze çözgen ilavesiyle yıkanması işlemine "sıyırma" veya "elüsyon" denir. Kolonun sonunda örnekteki madde konsantrasyonlarını algılayan bir detektör bulunması halinde alınan sinyaller zamanın fonksiyonu olarak simetrik eğriler verir (Şekil-2’nin alt kısmındaki eğriler). Böyle bir grafiğe "kromotogram" denir ve kalitatif/kantitatif analizlerde kullanılır. Piklerin konumları maddenin cinsini, alanları ise konsantrasyonlarını tanımlar.

Şekil-2: İki maddeli bir karışımın ayırma kromatografisi yöntemiyle ayrılması şematik diyagram

4. Sıyırma (Elüsyon) Kromatografisi Teorileri

Şekil-3'de, bir kromatografik kolonda A ve B maddeleri karışımı bir örneğin, sıyırma işleminin kısa ve uzun olması halinde verdiği konsantrasyon profili görülmektedir. Maddelerden A'nın ayrılma katsayısı B'ninkinden daha büyüktür; bu nedenle göç işlemi sırasında A geride kalır. Kolonun buyu uzadıkça iki pik arasındaki uzaklık artar. Ayni zamanda iki bandda da genişleme olur; bu durum kolonun ayırma verimini düşürür. Ancak göç mesafesi uzadıkça görülen bu band genişlemesi, ayni koşullarda bandların birbirinden ayrılma etkinliğine göre daha zayıftır. Böylece Şekil-3 ’de ikinci kısımdaki gibi iyi bir ayırım elde edebilmek için yeteri kadar uzun bir kolona gereksinim vardır.

İyi bir kromatografik ayırmada, (a) maddelerin göç etme hızı, ve (b) madde piklerinin genişlemeye başladığı bölgenin (uzaklık) tanımlanması önemlidir. Kromatografinin orijinal teorisi "tepsi teorisi" dir ve göç hızını kantitatif anlamda tarif eder. Ancak bu teori piklerin bölgesel genişlemelerine yol açan çok sayıdaki değişkeni açıklayamaz.

Bu nedenle tepsi teorisinin yerini, bu değişkenleri de tanımlayan "kinetik" veya "hız teorisi" almıştır.

Şekil-3: A ve B maddeleri kolondan aşağı ilerlerken iki ayrı noktada alınan konsantrasyon profilleri

Kinetik teoride kullanılan iki terim vardır: "teorik tepsi sayısı" ve "teorik tepsinin eşdeğer yüksekliği, TTEY" (veya teorik tepsinin yükseklik eşdeğeri). Bu iki terimi açıklayabilmek için tepsi teorisine kısaca değinmek gerekir. Kromatografi tepsi teorisini Martin ve Synge geliştirmiştir.

Buna göre bir kromatografik kolonun ayrı ayrı, fakat birbirine bitişik dar, yatay bir seri tabakalardan (teorik tepsi denen) oluştuğu varsayılır. Her tepside maddenin hareketli ve sabit fazlar arasında dengeye ulaştığı kabul edilir. Madde ve çözücünün hareketi, bir tepsiden diğerine kademeler halinde geçiş şeklindedir.

Kromatografik bir kolonun bir ayırma sistemi olarak verimi, denge sayısının artmasıyla yükselir, yani teorik tepsi sayısı arttıkça kolonun verimi de artar. Buna göre yukarıda belirtilen birinci terim "teorik tepsilerin sayısı, N" kolon veriminin bir ölçüsüdür. İkinci terim "eşdeğer tepsi yüksekliği, H"‘da bu kavrama yardımcı bir parametredir. Bu iki parametre arasında,

bağıntısı bulunur; L kolon dolgusunun yüksekliğini gösterir. Kolon verimi yükseldikçe H düşer, H 'ın küçülmesi kolonun belirli bir uzunluğundaki denge sayısının büyümesine yol açar. Kısaca, H küçük, N büyük olduğunda kolon verimliliği artar.  H ve N hız teorisinde verim parametreleridir ve denklem (2) uygulanabilir. Ancak bir kolonda fiziksel anlamda tepsi bulunamaz, tepsi  ve tepsi  yüksekliği terimleri kolon verimi için kullanılan birer değer birimleridir.

GERİ