I. Jenerasyon Sistemler:
El ile kumanda edilen ve gözlemin esas olduğu sistemledir; örneğin, büretler,
mekanik teraziler ve bazı kolorimetreler
gibi.
II. Jenerasyon Sistemler: Sonuçların bir anolog metrede veya kaydedicide görüntülendiği cihazların bulunduğu sistemlerdir.
III. Jenerasyon Sistemler: Cihazlara,
log ve işlem verisi için mikrobilgisayar arayüz eklenmesiyle hazırlanan
sistemlerdir.
1.2. Enstrümantal Metotlar
1920’li yıllara kadar analizlerin kütle ve hacim özelliklerine göre
yapılıyordu. Bu nedenle gravimetrik ve volumetrik analizler "klasik
yöntemler" olarak tarif edilir.
Diğer yöntemlere ise (spektroskopik, elektroanalitik ve
kromatografik). "enstrümantal analiz yöntemleri" denilmektedir.
Aşağıda analitik uygulamalarda kullanılan ve çok bilinen
bazı sinyallerle bu sinyal ölçümüne dayanan analitik metotlar verilmiştir.
·
Işın
Emisyonu: Emisyon spektroskopisi (X-ışını, UV, görünür, elektron,
Auger), fluoresans, fosforesans ve luminesans (X-ışını, UV, görünür)
·
Işın
Absorbsiyonu: Spektrofotometre ve fotometre (X-ışını, UV, görünür, IR),
fotoakustik spektroskopi, NMR ve ESR
·
Işın
Saçılması (scattering): Türbidimetre, nefelometre, Raman spektroskopi
·
Işın
Kırılması (refraksiyon): Refraktometre, interferometre
·
Işın
Kırınımı (difraksiyon): X-ışını ve elektron difraksiyon metotları
·
Işın
Rotasyonu: Polarimetre, optik döndürme dispersiyon, dairesel dikroizm
·
Elektrik
Potansiyeli: Potansiyometre, kronopotansiyometre
·
Elektrik
Yükü: Kulometre
·
Elektrik
Akımı: Polarografi, amperometre
·
Elektrik
Direnci: Kondüktometre
·
Kütle/Yük
Oranı: Kütle spektrometresi
·
Reaksiyon
Hızı: Kinetik metotlat
·
Termal
Özellikler: Termal gravimetri ve titrimetri, diferensiyal scanning kalorimetri,
diferensiyal termal analizler, termal kondüktometrik metotlar
·
Kütle:
Gravimetrik analizler
·
Hacim:
Volumetrik analizler
·
Radyoaktivite:
Aktivasyon ve izotropik seyreltme metotları
Birbirine çok benzeyen maddelerin ayrılması için yukarıda
verilen yöntemlerden başka analitik ayırma yöntemleri de vardır. Kromatografi,
distilasyon, ekstraksiyon, iyon değiştirme, fraksiyonlu kristalizasyon, ve
seçimli çökeltme işlemleri çeşitli ayırma ve saflaştırma yöntemleridir.
Enstrümantal tekniklerin çoğu klasik
yöntemler kadar hassas değildir. Karışımların analizlerinde ise enstrümantal
yöntemler daha başarılıdır. Enstrümantal veya klasik analizler için doğruluk,
uygunluk ve harcanan zaman gibi kıstaslara göre genel bir sınıflama yapılamaz.
Hatta kullanılan cihazlar yönünden bile, daha pahalı veya daha karmaşık, gibi
bir ayırım bile doğru olmaz; örneğin, gravimetrik bir analizde kullanılan
modern bir terazi bazı enstrümantal analiz cihazlarından daha karmaşık ve
pahalı bir cihazdır.
1.3. Analiz
Cihazları (Enstrümanlar)
Bir cihazın temel kısımları çoğunlukla dördü aşmaz.
Şekil-2’de şematik olarak görüldüğü gibi bu kısımlar sinyal jeneratörleri, dedektörler
(giriş transduserleri), sinyal prosesörleri (devreler ve elektrik aletleri) ve
oeri okuma aletleridir.
Şekil-2: Bir cihazın temel kısımları
Sinyal
Jeneratörleri: Sinyal jeneratörleri örnekteki maddelere ait analitik sinyaller
üretirler. Jeneratör örneğin kendisi olabilir. Analitik bir terazinin sinyali
tartılan örneğin kütlesidir; bir pH metre için ise sinyal, çözeltideki hidrojen
iyonlarının aktivitesidir. Diğer cihazların çoğunda sinyal jeneratörü çok
ayrıntılıdır. Örneğin, IR Spektrofotometrede sinyal jeneratörü, ışın kaynağı,
monokromatör, ışın chopperi (kesici), ayırıcı, örnek tutucu ve ışın aftenuatörü
(zayıflatıcı) gibi kısımlardan oluşur. Diğer bazı örnekler:
·
Fotometre:
Tungsten lamba, cam filtre, örnek
·
Atomik
Emisyon Spektrometre: Alev, monokromatör, kesici, örnek
·
Kulometre:
DC kaynak, örnek
·
pH
Metre: Örnek/cam elektrot
·
X-Işını
Toz Difraktometre: X-ışını tüpü, örnek
·
Renk
Komparatörü: Güneş ışını, örnek
Giriş
Transduserleri veya Dedektörler: Transduser bir tip sinyali başka bir
sinyal tipine çeviren bir alettir. Örneğin, ışığın ısısını elektrik voltajına
çeviren termokupl bir transduserdir; kadranlı bir barometredeki körükler basınç
sinyalini mekanik bir hareket sinyaline dönüştürürler. Enstrümantal analiz
cihazlarında karşılaşılan transduserlerin pek çoğu analitik sinyalleri elektrik
voltajı, akım, veya dirence dönüştürürler; çünkü elektrik sinyalleri
yükseltilebilir ve kaydedicide çizim veya yazım şeklinde alınabilirler.
·
Fotosel: Elektrik akımı
·
Fotomultiplier tüp: Elektrik potansiyeli
·
Elektrotlar: Elektrik akımı
·
Cam-kalomel elektrolar: Elektrik potansiyeli
·
Fotoğraf filmi: Görüntü
·
Göz: Optik sinyal
Sinyal Prosesörleri: Sinyal prosesörü dönüştürülmüş
sinyali, okuma aletine en uygun olacak şekilde değiştirir. En fazla
karşılaşılan değiştirme sinyalin kuvvetlendirilmesidir (amplifikasyon). Bunun
için sinyal 1’den büyük bir sabitle çarpılır. İki kefeli bir analitik terazide
kolun hareketi, bir gösterge ile kuvvetlendirilmiş olarak iletilir. Bir fotoğraf
filmi tarafından yapılan kuvvetlendirme çok daha büyüktür; burada tek bir foton
1012 tane gümüş atomu üretir. Elektrik sinyalleri de keza 106
kat veya daha fazla kuvvetlendirilebilirler.
Elektrik sinyallerinin kuvvetlendirilmesi yanında,
zayıflatılmasına (attenuasyon) da gereksinim olur; bu durumda sinyal,
prosesörde 1 den küçük bir sabitle çarpılır, integre edilir, ayrılır, eklenir
veya çıkarılır. Bundan sonraki uygulamalarda sinyal önce alternatif akıma ve
sonra da doğru akıma çevrilerek bir standartla kıyaslama yapılabilir. Böylece
akımdan voltaja (veya tersine) bir geçiş sağlanmış olur.
Veri Okuma Sistemi: Veri okuma sisteminde, prosesörden
yükseltilerek gelen sinyali kişinin okuyabileceği bir sinyale dönüştüren bir
transduser bulunur. Bunlar metreler, şerit kağıtlı kaydediciler, osilaskoplar,
işaretli cetveller, ve digital (rakamlı) göstergeler olabilir.
Tüm analitik metotlar kantitatif analiz amacıyla
kullanıldıklarında kalibrasyona gereksinim vardır. Kalibrasyon, bir enstrüman
çıkışında ölçülen analitik sinyalin analitin konsantrasyonuyla olan ilişkisinin
doğru olarak saptanması amacıyla yapılan bir işlemdir: Sinyalin (veya
responsun) kalibrasyonu yapılmadan bir örnek için alınan verilerle
konsantrasyon bağıntısı elde edilemez.
Bir kalibrasyon metodunun özgünlüğü kesinlik, doğruluk,
bias, hassasiyet, algılama sınırları, seçicilik ve uygulanabilir konsantrasyon
aralığına bağlıdır. Bu kavramlar aşağıda kısaca açıklanmıştır.
Kesinlik
(Precision): Metodun
tekrar üretilebilirliğinin (reproduciblility) bir ölçüsüdür; aynı şekilde elde
edilen sonuçlar birbirlerine ne kadar yakın değerlerdedir? Rastgele (random)
hatalar standart sapmayla izlenebilir; genellikle % relatif sapma değeriyle
ifade edilir.
Analitik Metotların Kesinlik (Precision) Tanımları:
Doğruluk (Accuracy): Ölçülen değer gerçek değere ne kadar yakındır? Normal olarak % relatif hata (mutlak hata olabilir) ile tanımlanır; örneğin, %1 hata, ölçülen konsantrasyonun gerçek analit konsantrasyonunun %1 sınırı içinde doğrudur.
Bias: Bir ölçmenin sistematik hatasının
göstergesidir; enstrümantal, personel ve metot hatalarından kaynaklanır. Mutlak
hata olarak ifade edilir. m, tüm
değerlerin ortalaması; xi, gerçek değeri gösterir. bias = m - xi
Hassasiyet
(Sensitivity): Hassasiyet
iki faktöre bağlıdır; kalibrasyon eğrisinin eğimi (eğimin dikliğiyle artar) ve
ölçümlerin birbirine yakınlığı.
S = m C + Sşahit
S = ölçülen sinyal, C = analitin konsantrasyonu, Sşahit = şahitin sinyali, m = kalibrasyon eğrisinin eğimi, Si = analitik sinyal.
Seçicilik
(Selectivity): Uygulanan
metodun örnek matrisindeki diğer maddelerden etkilenmemesini belirten bir
derecedir. S = analitik sinyal, Sşahit = şahitin sinyalini gösterdiğinde,
S = mACA +
mBCB + mCCC + Sşahit
CA, CB, CC = A, B ve C
konsantrasyonları; mA, mB, cC = A, B ve C
maddelerinin kalibrasyon eğrisi eğimindeki değerleridir.
kB,A = B için seçicilik faktörü (A’ya göre), kC,A
= C için seçicilik faktörü (A’ya göre)
S = mA (CA
+ kB,A CB + kC,A CC) + Sşahit
Seçicilik faktörleri 0 ile >>1 arasındadır; girişimler
gözlenen sinyali azaltırsa negatif olabilir.
Algılama
(Detection) Sınırları:
Bilinen bir güvenilirlik seviyesinde saptanabilen minimum ağırlıktaki (veya
konsantrasyondaki) analit miktarıdır.
Sm
= minimum ayırt edilebilen analitik sinyal, Sm = Sşahit + ksşahit
Sşahit = şahit sinyali ortalaması, k = sabit (~ 3),
sşahit = şahitin mutlak standart sapmasıdır.
Sşahit ve
sşahit değerlerinin bulunması için 20-30 ölçme gerekir.
Uygulanabilir Konsantrasyon Aralığı: Teorik olarak absorbansın konsantrasyonla orantılı olması gerektiği halde çoğu zaman doğrusallıktan sapmalar olur. Bu nedenle kalibrasyon eğrilerine gereksinim vardır. Ayrıca, analizin yapıldığı zaman en az bir standardın absorbansı tekrar ölçülerek atomik buhar elde edilirken kontrol dışı kalan değişkenlerin neden olduğu hatalar saptanır. Böylece standardın orijinal kalibrasyon eğrisinden gösterebileceği sapma, örnek için elde edilen sonuçların düzeltilmesinde kullanılır.
Uygulanabilir Konsantrasyon Aralığı: Teorik olarak absorbansın konsantrasyonla orantılı olması gerektiği halde çoğu zaman doğrusallıktan sapmalar olur. Bu nedenle kalibrasyon eğrilerine gereksinim vardır. Ayrıca, analizin yapıldığı zaman en az bir standardın absorbansı tekrar ölçülerek atomik buhar elde edilirken kontrol dışı kalan değişkenlerin neden olduğu hatalar saptanır. Böylece standardın orijinal kalibrasyon eğrisinden gösterebileceği sapma, örnek için elde edilen sonuçların düzeltilmesinde kullanılır.
Dinamik Aralık:
Eğrinin doğrusal olan kısmının kullanılması tercih edilir; bu bölümde analitik sinyal,
analitin miktarıyla doğru orantılıdır. Dinamik aralığın üstündeki analit
konsantrasyonlarında respons değerinde yükselme görülmez. (Şekil-3).
Şekil-3: Bir kalibrasyon eğrisi grafiği; cihaz responsu-konsantrasyon
değişimi
Algılama Sınırı
(Limit of Detection, LOD): Makul bir kararlılıkla ölçülebilen en düşük
içeriktir. Tipik olarak S/N (sinyal/gürültü)nün 3 katıdır; gürültünün standart
sapmasına dayanır.
Kantitatif Ölçme
Sınırı (Limit of Quantitative Measurement, LOQ): Uygulanan test koşullarında
kabul edilebilir hassasiyet (tekrarlanabilirlik) ve doğrulukla tayin edilebilen
en düşük analit konsantasyonudur. Tipik olarak S/N’nün 10 katıdır.
Doğrusal Respons
Sınırı (Limit of Linear Response, LOL): Bir enstrman dedektörünün doygunluk
noktasıdır; bu noktadan sonra sinyalde doğrusal bir respons üretemez.
En çok uygulanan bazı kalibrasyon yöntemleri: 1. Kalibrasyon
eğrisi metodu, 2. standart ilavesi metodu, 3. iç standart metodu, 4. alan
normalizasyonu metodu.
a. Kalibrasyon
Eğrisi Metodu: Kalibrasyon eğrilerinin doğrusal
olması, yani cihaz responsuyla hemen hemen orantılı olması istenir. Kalibrasyon
eğrisi kullanabilmek için analitin konsantrasyon aralığı tahmin edilebilmeli, örneğin
matris koşulları değerlendirilmelidir.
·
Örneğin
matris koşullarına benzer koşullarda bir takım standart hazırlanır;
standartlar, tahmin edilen konsantrasyon aralığını kapsayacak seviyelerde
olmalıdır.
·
Analit
içermeyen bir şahit hazırlanır.
·
Standartlar
ve şahit analiz cihazında ölçülür ve elde edilen değerlerle bir kalibrasyon
grafiği çizilir.
·
Bir
kalibrasyon eğrisinin çizilebilmesi için, normal olarak, en az 3 standart ve
bir şahit kullanılır.
·
Örneğin
(analit konsantrasyonu bilinmiyor) ölçümü yapılır; alınan respons kalibrasyon
eğrisinin dinamik aralığı içindeyse, konsantrasyon hesaplanır.
ÖRNEK-1
Ultraviyole ve Görünür Spektrofotometrede Co+2 Tayini: Analiz edilecek örneğe (bilinmeyen) uygun analiz koşulları saptandıktan sonra bir seri standart çözelti kullanılarak kalibrasyon eğrisi hazırlanır. Standartlar, örneğin konsantrasyonuna yakın değerlerde olmalıdır.
·
Kobalt iyonu (Co+2) miktarının tayini
için spektrumda çalışma dalga boyu saptanır; ~500 nm.
·
Beş adet konsantrasyonu bilinen standart ve
analit içermeyen bir şahit çözelti hazırlanır ve 520 nm’deki absorbans
değerleri okunur.
·
AS
değerlerine karşı konsantrasyonu gösteren kalibrasyon grafiği çizilir.
Grafik bir doğru şeklindedir (Şekil-4). Örneğin absorbans
değeri okunur.
AX = 0.447 (beş
okumanın ortalaması)
Doğrunun eğimi (m), enstruman responsunun konsantrasyonla
ilişkisini; y eksenini kestiği değer (b) ise, şahitin, veya enstrumanın analit
bulunmadığı haldeki responsudur. Bu değerin her ölçme sonucundan çıkarılması
gerekir.
m = 0.0456 b = 0.0231
Şekil-4:
Co+2 tayinini için elde edilen veriler ve kalibrasyon eğrisi
m = 0.0456 (m kalibrasyon
eğrisinin eğimidir)
Analitik hassasiyet g
nedir?
Bu değer konsantrasyonla değişir; dolayısıyla eğri
üzerindeki her değer için g hesaplanır.
konsantrasyon
|
g = m/Si
|
konsantrasyon
|
g = m/Si
|
2.13
|
5.0
|
15.33
|
3.5
|
5.63
|
4.2
|
21.71
|
3.2
|
10.29
|
4.4
|
b. Standart Katma Metodu: Standart katma yöntemi, çoğu zaman,
örneğin içeriğinin bilinmediği veya kompleks bir karışım olduğu ve analit
dışındaki diğer başka maddelerin (safsızlıklar) de sinyali etkilediği
durumlarda uygulanan bir kalibrasyon işlemidir. Böyle hallerde matriks, örnek
içinde bulunan analitten başka diğer her şeydir; responsu değiştiren bu tür
etkilere ‘matriks etkisi’ denilir. Örnekte bulunan safsızlıklar analitle
etkileşerek cihaz responsunu değiştirirler veya kendi başlarına özel cihaz
responsları üretirler. Bu gibi durumlarda saf analit örneklere göre hazırlanan
bir kalibrasyon eğrisi yanlış sonuç verir.
Örneğin, Şekil-5’de, kütle spektrometreyle yapılan,
matriksin saf su ve yer altı suyu olması hallerinde perklorat kalibrasyon
eğrilerinin ne kadar farklı oldukları açıkça görülmektedir.
Şekil-5: Perkloratın farklı matrisler için kalibrasyon eğrileri
En ideal durum kalibrasyon standartlarının örnek matrisindeki
hem analit hem de diğer maddelerin konsantrasyonlarına yakın miktarlarda
bileşen içermesidir; böylece, örnekteki diğer maddelerin, ölçülen analit
absorbansına etkisi en aza indirilmiş olur. Örneğin, renkli pek çok metal iyonu
komplekslerinin absorbansı ortamda sülfat veya fosfat iyonlarının varlığında
azalır; çünkü bu iyonlar metal iyonlarıyla renksiz kompleksler oluştururlar.
Böyle bir durumda elde edilen absorbans değeri gerçek değerinden düşük olur.
Sülfat veya fosfatın matriks etkisi standartlara, bu iyonlardan örnekte
bulundukları miktara yakın miktarlarda ilavesiyle yenilir. Ancak, topraklar,
mineraller, ve fabrika külleri gibi örneklerin analizinde, örneğe benzer
bileşimde standartların hazırlanması olanaksız veya çok zordur. Bu gibi durumlarda
matriks etkisini yok edebilmek için "standart ilavesi yöntemi"
uygulanır.
Standart katma birkaç şekilde yapılabilir. Zaman kazanmak veya az miktarda
örnekle çalışılması gerektiğinde standart ilavesi örneğin sadece iki versiyonu
ile yapılabilir. Örneklerde birine VS mL standart konulur, diğerine
konulmaz. Her iki balon da seyreltilerek sabit hacme tamamlanır. Bu
yöntem voltametrik ve potansiyometrik ölçmelerde çok kullanılır.
Fotometrik ve spektrofotometrik çalışmalarda en çok
uygulanan yöntem ise, aynı miktardaki örneklere standart bir çözeltiden artan
miktarlarda ilaveler yapılmasıdır. İlavelerden sonra çözelti sabit bir hacme
tamamlanır ve absorbansları saptanır.
İki Ölçmeyle
Yapılan Hesaplama Yöntemi: Örnekten volumetrik bir balona bir miktar (VX) alınır
ve gerekli maddeler (pH tampon, kompleks yapıcı, v.s. gibi) ilave edilir,
seyreltilerek sabit hacme (VT) tamamlanır. Buna (1) diyelim.
Diğer bir volumetrik balona aynı şekilde örnek ve gerekli
maddeler konulur; ilave olarak 5.00 ml analit standart çözelti ilave edildikten
sonra seyreltilerek sabit hacme (VT) tamamlanır. Buna (2) diyelim.
·
(1) ve (2)’nin sinyalleri ölçülür; A1
ve A2.
·
Sinyaller analit konsantrasyonuyla orantılıdır.
·
k orantı sabitini, CX örnekteki
analit konsantrasyonunu gösterdiğine göre:
ÖRNEK-2
Sodyum iyonu içeren serum numunesi, atomik emisyon
analizinde 4.27 mV sinyal vermektedir. Bu örnekten 95.0 mL alınarak, 2.08 M
NaCl çözeltisinden 5.00 mL ilave edilmiştir; hazırlanan bu standardın sinyali
ise 7.98 mV olarak ölçülmüştür. Serumdaki sodyum iyonu konsantrasyonu ne
kadardır? [Na+] ? M. Sinyaller analit konsantrasyonuyla orantılıdır.
Hazırlanan standart (100 mL) karışımdaki Na+
konsantrasyonu, 95 mL serumdaki ve ilave edilen 5 mL 2.08 M çözeltideki Na+
iyonları toplamına eşittir.
Atomik emisyon analizinde okunan sinyaller:
Sinyal ve konsantrasyonlar orantılı olduğundan, aşağıdaki eşitlikle serumdaki Na+ konsantrasyonu hesaplanır.
·
Örnekten volumetrik bir balona bir miktar (VX)
alınır ve gerekli maddeler (pH tampon, kompleks yapıcı, v.s. gibi) ilave
edilir, seyreltilerek sabit hacme (VT) tamamlanır.
·
Diğer bir seri volumetrik balona aynı şekilde
örnek ve gerekli maddeler konulur; ilave olarak sırasıyla 5.00, 10.00, 15.00,
20.00, 25.00 ml analit standart çözelti ilave edildikten sonra herbiri
seyreltilerek sabit hacme (VT) tamamlanır. Standardın konsantrasyonu
8.7 ppm’dir.
·
Hazırlanan beş standardın ölçümü yapılır; her
biri kendine özgü sinyal değeri verir (Sİ).
·
Sinyal değerleri, ilave edilen standardın
hacimlerine karşı grafiğe alınır; grafik bir doğrudur.
·
Elde edilen grafiğin eğimi ve y eksenini kestiği
noktadaki sinyal değeri saptanır; bu değerler numunedeki analit miktarını
hesaplamada kullanılır.
·
Hazırlanan
çözeltilerin her birindeki analit konsantrasyonu enstrümantal yöntemle ölçülür.
Enstrümanın
responsu (A) analit konsantrasyonuyla orantılı ise aşağıdaki eşitlik
yazılabilir.
VX =örneğin hacmi, = 25 mL olduğu varsayılsın. VS = standardın hacmi = değişken (5, 10, 15, 20 mL, gibi), VT = balonun toplam hacmi = 50 mL, CS = standardın konsantrasyonu, CX = alınan örnek içindeki analitin hacmi (burada 25 mL), k = orantı sabitidir. A’nın VS’nin fonksiyonu olarak çizilen grafiği düz bir doğrudur.
VX =örneğin hacmi, = 25 mL olduğu varsayılsın. VS = standardın hacmi = değişken (5, 10, 15, 20 mL, gibi), VT = balonun toplam hacmi = 50 mL, CS = standardın konsantrasyonu, CX = alınan örnek içindeki analitin hacmi (burada 25 mL), k = orantı sabitidir. A’nın VS’nin fonksiyonu olarak çizilen grafiği düz bir doğrudur.
Şekil-6: Standart ilavesi
kalibrasyon metodunda çözeltilerin hazırlanması
Elde
edilen Şekil-7’deki grafik kullanılarak örnekteki analit konsantrasyonunun (CX)
saptanması için iki yol izlenebilir.
1. CX’in Tayini İçin
Birinci Yol: Doğrumun
eğimi m, y eksenin
kestiği nokta b
ile gösterildiğinde,
Şekil-7: Enstrümanın
responsunun (A) analit konsantrasyonuyla değişmesi
2. CX’in Tayini İçin
İkinci Yol: CX’in
tayini için başka bir yol da izlenebilir. Ölçme sonuçlarıyla çizilen doğru
ekstrapole edilerek X eksenini kestiği nokta saptanır.
VS
= 0 noktası ® enstrüman responsudur. Doğrunun X
eksenini kestiği nokta ® ilave
edilen analit miktarı bilinir (içsel). Veya bu noktada A = 0 olduğundan (enstrüman
responsu yok) ® örnekte analit bulunmaz.
A = 0
olduğunda,
Çok sayıda ölçmeyle yapılan kalibrasyonda bir örnek için Şekil-8’deki
verilerin elde edildiği varsayılsın. Örnekteki analit konsantrasyonu CX
ne kadardır?
CX = örnekteki analit konsantrasyonu, CS
= standarttaki analit konsantrasyonu
Şekil-8: Çok sayıda ölçmeyle yapılan
kalibrasyon verileri
1. Şekil-8’deki gafikten,
2. Standart ilavesi yönteminde yukarıda görüldüğü gibi
hesaplamayla değil grafikteki değerlerde yapılan okumalar daha kolaydır.
Bir doğru şeklinde elde edilen grafikteki doğru ekstrapole
edilerek x-eksenini kestiği, yani sinyalin sıfır olduğu nokta saptanır. Bu
nokta, örnekteki (bilinmeyen) analit miktarıyla ayn miktarda analit içeren
Standard çözeltinin hacmini tanımlar.
c. İç
Standart Metodu: Bir
iç standart, bilinmeyen örneğe ilave edilen ve analitten farklı olan, miktarı
bilinen bir bileşiktir. İç standartlar çeşitli rastgele ve sistematik hataları
dengeler.
Bir iç standart, örnek, şahit ve kalibrasyon standartlarına
aynı miktarda ilave edilen bir maddedir.
Standartlardan alınan ölçme sonuçları, ‘analit sinyali / iç
standart sinyali’ değerleri standartlardaki analit konsantrasyonlarına göre
grafiğe alınır.
Örnek için elde edilen ‘analit sinyali / iç standart
sinyali’ oranından, kalibrasyon eğrisi kullanılarak analitin konsantrasyonu
bulunur.
Şekil-9: Analit ve iç standart sinyallerinin görünümleri
Analit sinyalinin iç standart sinyaline oranı analitik
parametre olarak kullanılır. Yöntemin başarılı olabilmesi için iç standart sinyalinin
örnekteki diğer maddelerin piklerinden uzakta (RS > 1.25), analit
pikinin yakınında olması tercih edilir. Uygun bir iç standart kullanıldığında
relatif hata %0.5-1 civarındadır.
Respons faktörü, RX/S:
Bilinen miktarlarda analit ve standart içeren bir karışım hazırlanır. Dedektör,
genelikle, karışımdaki her bir madde için farklı responslar verir; böylece
analit için bir respons faktörü saptanır. AX, AİS analit
ve iç standart için responslar, mX, mİS injekte edilen
analit ve iç standardın kütleleri, CX, CİS injekte edilen
analit ve iç standardın konsantrasyonlarıdır.
İç standart yöntemi kromatografik analizlerde yaygın olarak
uygulanan bir kalibrasyon yöntemidir.
Tek İnjeksiyonla
Hesaplama Yöntemi:
Tek injeksiyonla hesaplamada, örneğe bilinen miktarda bir iç standart ilave
edilir. Analit için saptanan respons faktörden örnekteki analit miktarı
hesaplanır.
Standardın analizi için X maddesinden ve İS (iç standard)
maddesinden,1 ng injekte edilir, ölçüm yapılır; standart için elde edilen değerler:
Örneğin analizi için, örneğe 1.00 ppm iç standart ilave edilir ve ölçüm yapılır; elde edilen değerlerden analit miktarı (CX) hesaplanır.
Örneğin analizi için, örneğe 1.00 ppm iç standart ilave edilir ve ölçüm yapılır; elde edilen değerlerden analit miktarı (CX) hesaplanır.
Kalibrasyon Eğrisiyle Hesaplama Yöntemi: İç standart miktarı sabit, analit miktarı
değişken olan (farklı mX/mS değerlerinde) bir seri
standart hazırlanır, her birinin kromatogramları alınır. Standartların kromatogramlardan hesaplanan AX/AS
değerlerinin mX/mS değerlerine karşı grafiği çizilir;
eğri, eğimi respons faktörü olan bir doğrudur. Örnekteki analitin miktarının
bulunması için, örneğe, bilinen miktarda iç standart maddesi ilave edilir. Örnek
+ iç standart karışımının kromatogramından AX/AİS değeri
bulunur ve kalibrasyon eğrisinden analit konsantrasyonu (CX)
hesaplanır.
Kalibrasyon Eğrisi Standartları
Standart
|
X maddesi mg/mL
|
İç standart, mg/mL
|
CX/CİS
|
AX
|
AİX
|
AX/AİS
|
1
|
2.50
|
5.00
|
0.500
|
120
|
600
|
0.200
|
2
|
5.00
|
5.00
|
1.000
|
241
|
601
|
0.401
|
3
|
10.00
|
5.00
|
2.000
|
480
|
600
|
0.800
|
4
|
25.00
|
5.00
|
5.000
|
1198
|
600
|
1.997
|
Kalibrasyon eğrisinin çizilmesi için tabloda görüldüğü gibi,
dört standart hazırlanmıştır;
·
Her standartta 5 00 mg/mL iç standart vardır.
·
AX/AİS değerleri CX/CİS
değerlerine karşı grafiğe alınır.
·
Kalibrasyon eğrisi, eğimi respons faktörü olan
bir doğrudur.
Örneğin analizi için örneğe bilinen miktarda iç standart (CİS)
ilave edilir ve hazırlanan karışım cihaza injekte edilir. AX/AİS
değeri ölçülür, alibrasyon verilerinden CX/CİS değeri
bulunur ve CX hesaplanır.
Şekil-10:
İç standart metodunda kalibrasyon eğrisiyle hesaplama yöntemi
d. Alan Normalizasyonu Metodu: Örnek injeksiyonundaki düzensizliğin
yaratığı hata alan normalizasyonu ile de giderilebilir. Bu yöntemde örnekteki
tüm maddelerin kolondan çıkması gerekir. Kromatogramdaki tüm piklerin alanları
hesaplanır ve her madde için bilinen detektör algılama faktörü ile çarpılarak
düzeltilir. Analitin konsantrasyonu, analit pikine ait alanın toplam pik
alanlarına bölünmesiyle hesaplanır. Örnekte
bulunan her bir analit için bir standart hazırlanır ve kromatogramı alınır,
relatif dedektör responsu hesaplanr.
pik alanı
relatif respons = ¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾
injekte edilen miktar
Bir seri solut için relatif dedektör responslar normalize
edilerek istenilen respons faktörlere dönüştürülebilir; örneğin, her bir değer
en büyük değere bölünür.
relatif respons
respons faktörü = ¾¾¾¾¾¾¾¾
en
büyük değer
Elde edilen alan değerleri (ham veriler), respons faktörlere
bölünerek indirilmiş alanlar bulunur, bu değerler miktarla orantılıdır (%kütle,
%hacim, %ağırlık, … ).
alan
indirilmiş alan = ¾¾¾¾¾¾¾¾
respons faktörü
Her bi bileşenin % değeri bulunur.
indirilmiş alan x100
ağırlık, % = ¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾
indirilmiş alanlar toplamı
Butil-alkoller karışımı
bir örneğin kromatogramının alan ormalizayon yöntemine göre incelenmesi. Detektör
hassasiyeti düzeltme faktörleri bilinen miktarlarda saf alkoller kullanılarak
ayrı deneylerde saptanmıştır.
RF (respons faktör) = normalize edilmemiş relatif
resons/listedeki en büyük değer; bunlar, injekte edilen eşit miktarlardaki
solutun, en byük değer için 1’e normalize edilmesiyle bulunan alanlardır.
Standartlar için elde edilen veriler
Alkol
|
Ağırlık, g
|
Ağırlık, %
|
Pik alanı, cm2
|
Relatif respons (Alan, %ağ.)
|
RF (respons faktör)
|
n-bütil
|
0.1731
|
24.61
|
3.023
|
0.1229
|
0.8496
|
i-bütil
|
0.1964
|
27.92
|
3.074
|
0.1101
|
0.7615
|
s-bütil
|
0.1514
|
21.52
|
3.112
|
0.1446
|
1.0000
|
t-bütil
|
0.1826
|
25.96
|
3.004
|
0.1157
|
|
Toplam
|
0.7035
|
100.00
|
12.213
|
0.1446
|
Örnekler için elde edilen veriler: Elde edilen alan
değerleri (ham veri), respons faktörlere bölünerek indirilmiş alanlar bulunur,
bu değerler %ağırlıkla orantılıdır.
indirilmiş alan x100
Ağırlık, % = ¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾
indirilmiş alanlar toplamı
Örnekler İçin Elde Edilen Veriler
Alkol
|
Alan
|
RF
|
Alan/RF
|
Ağırlık, %
|
n-bütil
|
1.731
|
0.8496
|
2.0374
|
18.18
|
i-bütil
|
3.753
|
0.7615
|
4.9287
|
43.98
|
s-bütil
|
2.845
|
1.0000
|
2.8450
|
25.39
|
t-bütil
|
1.117
|
0.8004
|
1.3956
|
12.45
|
Toplam
|
11.2067
|
100.00
|
2. Elektrot Kalibrasyonu
1. En az iki
standart tampon seçilerek ölçülecek pH değerinin bu tamponların pH değerleri
arasında bulunması gerekir:
Örneğin pH değeri 5 dolayında ise, standartların pH’larının,
pH = 4 ve pH = 7 olması önerilir.
Örneğin pH
değeri 3 dolayında ise, standartların pH’larının,
pH = 2 ve pH = 4 olması önerilir.
2. Cam
elektrodun responsu daima voltj veya mV olarak kaydedilir.
Cam
Elektrodun Responsu (Algılaması): Elektrot kalibre edilirken pH değeri değil, cam elektrodun voltaj
değeri ölçülür. Yeni bir elektrot, ortam koşullarında, 60 mV/pH dolayında bir
respons verir.
·
pH
= 7 – 4 arasında elektrot potansiyeli »+180 mV kadar yükselir.
·
pH
= 7 – 10 arasında elektrot potansiyeli »+180 mV kadar düşer.
Elektrot
yaşlandıkça kalibrasyon doğrunsun eğimi azalır, respons zamanı da uzar; yani,
elektrodun cevap vermesi yavaşlar. Reasponsun 60 mV’un önemli derecede altına
düşmesi ve respons zamanının da çok yavaşlaması durumunda elektrot kullanılamaz
hale gelmiş demektir.
Cam elektrodun
responsunun yavaşlaması kalibrasyon doğrusunun eğiminin düşmesiyle de kendini
gösterir.Yaşlanan elektrodda gözlenen bu durumun nedeni, zamanla elektrodun
organik ve inorganik iyonlarla kirlenmesidir. Organik iyonlar membranda
adsorblanır, Na+ ve K+ gibi inorganik iyonlar ise jel tabakasına girerler. Şekil-11’de bir cam pH elektrodu
görülmektedir.
1. Yanlış kalibrasyon: Ölçülen pH değeri standartlardan
daha doğru olamaz (±0.01 pH). Kalibrasyonda kullanılacak tamponun hatalı
hazırlanması veya hazırlanmış tamponun bekleme nedeniyle bileşiminin değişmesi
(organik kısımlar bakteriler tarafından etkilenerek tamponun zamanla
kirlenmesine neden olur) pH ölçümünde hatalı sonuçlara yol açar.
2. Sodyum (alkali) hatası: Yüksek pH değerlerinde elektrodun
Na+ iyonlarını algılamasından kaynaklanır; okunan pH değeri, gerçek
değerden daha düşüktür. Herhangi bir cam elektrot pH > 9 'da alkali metal
iyonlarına karşı kısmen duyar olmaya başlar.
3. Asit hatası: Çok düşüş pH değerlerinde ortaya
çıkar. pH < 0.5 ‘in altındaki değerlerde cam elektrotlarla elde edilen
sonuçlar gerçek değerlerden bir miktar yüksektir.
RT
E = E0 + ¾¾¾ ln (aH+ + kH+,Na+ aNa+)
nF
Şekil-12: Sodyum ve asit hataları
4. Sıcaklık değişikiliğinin etkisi: pH metrede normal sıcaklık düzeltmesi sadece pH elektrodundan alglanan mV değerinde yapılır, fakat çözeltideki sıcaklık değişiklikleri cihaz tarafından düzeltilemez. Çözeltide pH’ın sıcaklıkla değişimini düzeltebilmek için, çalışılan çözeliyle bir pH-sıcaklık kalibrasyonu yapılır; deney sonuçları bu kalibrasyon değerlerine göre düzeltilir. Modern pH metrelerde, hazırlanan pH-kalibrasyon değerleri cihazın programına girilerek düzeltmenin cihaz tarafından yapılması sağlanabilmektedir.
(Temas
potansiyelindeki değişiklikler ve elektrot neminin kaybolması da elektrotlarda
karşılaşılan diğer hata kaynaklarıdır.)
